新霉素人工抗原的构建、多克隆抗体的制备及检测方法的初步研究

摘要

新霉素(Neomycin，NEO)属于氨基糖苷类抗生素，具有抗菌谱广的特点，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和结核杆菌均有良好的抑制作用，在兽医临床上应用广泛，是重要的抗感染药物，还被普遍用于治疗乳腺炎、角膜炎、结膜炎、耳炎、皮炎、外伤感染、足腐烂等疾病。我国和其它一些国家还将新霉素作为饲料抗生素添加剂使用，用于预防畜禽感染引起的早期损失和肠炎，提高饲料利用率，促进生长。 虽然新霉素在兽医和畜牧上使用取得了巨大的成功，但其对人和动物存在潜在的耳毒性和肾毒性，为了公众的健康，对食物中新霉素残留进行检测十分必要。为了有效检测动物及食品里新霉素的残余物，保护消费者，需要研究一种简单快速有效的检测方法。 酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)在抗生素残留检测的领域应用相当广泛。建立新霉素ELISA检测方法首先需要获取高质量、稳定的新霉素人工抗原。针对新霉素没有特征紫外吸收的特点，本论文建立了新霉素人工抗原的红外光谱分析法，对新霉素人工抗原的质量进行检测。并在此基础上优化人工抗原制备方法，制备新霉素人工抗原，获取新霉素抗血清，并初步建立新霉素ELISA检测方法。 到目前为止，我国还没有新霉素残留ELISA检测方法的研究报道。因此，研发新霉素残留ELISA检测方法具有很强的社会意义和经济意义。 本论文取得如下结果： 1.建立新霉素人工抗原的红外光谱分析方法。根据新霉素没有特征紫外吸收的特点，采用红外光谱来对新霉素人工抗原进行分析，建立新霉素人工抗原的红外光谱分析方法，为氨基糖苷类抗生素的抗原检测提供了新的技术支持。 2.优化新霉素人工抗原偶联方法。以红外光谱分析为基础，优化新霉素和载体蛋白的偶联条件，确定反应温度25℃，偶联剂浓度8.3mg/mL。 3.成功制备稳定性好的新霉素人工抗原BSA-NEO和KLH-NEO。采用优化后的偶联方法，分别将新霉素和牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、血蓝蛋白(keylaole limpet hemocyanin，KLH)进行偶联，得到新霉素人工抗原BSA-NEO和KLH-NEO。通过红外光谱分析，初步测定BSA和NEO偶联比率为1：3，KLH和NEO偶联比率为1：10。 4.成功制备新霉素高效价抗血清。将偶联成功的人工抗原BSA-NE和KLH-NEO作为新霉素免疫抗原，免疫新西兰大白兔，获得抗血清。分别将BSA-NEO和KLH-NEO作为包被抗原，采用间接ELISA法测定KLH-NEO抗血清和BSA-NEO抗血清的效价，测定抗血清效价。用BSA-NEO免疫的两只新西兰大白兔产生的抗血清效价达到1.28×10<'5>以上，用KLH-NEO免疫的一只新西兰大白兔产生的抗血清效价达到:1.28×10<'5>以上，另外一只产生的抗血清效价相对较低。新霉素抗血清的制备成功，进一步论证新霉素人工抗原红外光谱分析法的可行性。 5.优化直接竞争ELISA反应条件并建立新霉素标准曲线。确定最佳包被抗血清浓度为1：1000稀释，最佳HRP-NEO浓度为1：500稀释，最佳反应时间60min。建立新霉素回归方程y=-16.475x+113.76，R<'2>=0.9962，标准曲线平均变异系数3.82％。检测极限27.67 ng/mL，达到国家对新霉素规定的500μg/kg MRL 检测限。 6.优化间接竞争ELISA反应条件并建立新霉素标准曲线。确定最佳酶标二抗浓度为1：2000稀释，最佳抗血清浓度为1：2000稀释，最佳包被抗原浓度1：400稀释，最佳反应时间60min。建立新霉素回归方程y=-11.35x+109.36，R<'2>=0.9945，标准曲线变异系数1.71％，检测极限51.29ng/mL，达到国家对新霉素规定的500μg/kg MRL检测限。 7.在间接竞争ELISA法下，新霉素抗血清和庆大霉素的交叉反应率为2.04％，和卡那霉素的交叉反应率为0.02％，和氨苄青霉素、红霉素、四环素的交叉反应率小于0.01％，说明新霉素多克隆抗体在间接竞争ELISA体系下可以特异性的识别新霉素，测定时不受其它抗生素影响。初步测试新霉素间接竞争ELISA法回收率为132.5％～246.5％。

目录

声明

前言

第一章新霉素人工抗原的合成和检测方法的建立

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1新霉素人工抗原红外光谱分析法

2.2偶联条件优化

2.3新霉素人工抗原的制备

2.4新霉素人工抗原稳定性

3.讨论

3.1人工抗原红外光谱分析法

3.2偶联方法的选择

3.3新霉素与载体蛋白偶联比率的估算

3.4新霉素与蛋白质偶联比率的控制

第二章新霉素多克隆抗体的制备及效价测定

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1免疫双扩散法测定效价

2.2 ELISA法测定效价

2.3抗血清稳定性

3.讨论

3.1包被抗原的选择

第三章新霉素检测方法的初步研究

1.材料和方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1直接竞争ELISA法

2.2间接竞争ELISA法

3.讨论

3.1两种竞争ELISA法的比较

3.2交叉反应率

3.3新霉素间接竞争ELISA法的进一步研究

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表论文及获奖情况

致谢

综述 动物性食品中抗生素类药物残留的危害及检测