赭曲霉毒素A人工抗原构建及其多克隆抗体的制备

摘要

赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OA)是一种有毒性的真菌次级代谢产物,主要由某些曲霉和青霉产生,可污染粮食、蔬菜及咖啡、葡萄、可可等经济作物,由于可污染物种很多,且产毒菌株可适应的环境广泛,因此已造成了全球的广泛传播。它具有较强的肾毒性和肝毒性,并具有致畸性、致癌性、免疫毒性和胚胎毒性,很多国家都设立了限量标准,因此建立成本低且快速有效的现场检测方法极为重要。免疫学方法由于其快速、高灵敏度、高特异性、成本低以及携带操作方便等优点已得到广泛的青睐。
　　 本实验采用活性酯法将OA与载体蛋白偶联制得人工抗原,经过紫外、红外、荧光光谱以及圆二色谱对其进行了比较全面的鉴定分析,并通过荧光猝灭进一步探讨了OA与载体蛋白的反应机制,随后免疫BALB/c小鼠,研究了抗血清的各项特性,并进行了加标回收和实际样品检测,建立了间接竞争ELISA。
　　 1赭曲霉毒素A人工抗原的构建
　　 OA是小分子物质,分子量仅为403.8,因此属于只有反应原性而无免疫原性的半抗原,只有通过与载体蛋白偶联构建成人工抗原后才能有效地刺激机体产生抗体。本研究利用OA结构中的羧基,采用活性酯法将OA与牛血清白蛋白(bovine serumalbumin,BSA)和卵清蛋白(ovalbumin,OVA)偶联,制备免疫抗原OA-BSA和包被抗原OA-OVA。
　　 通过紫外、红外、荧光光谱以及圆二色谱法对人工抗原进行分析,在紫外光谱中,载体蛋白与OA的结合导致OA酚羟基pKa降低,以致吸收峰红移至380nm处,OA与BSA和OVA的偶联摩尔比分别达到11:1和7.6:1,OA的利用率分别为50.5％和38.6％。；在红外光谱中,较载体蛋白而言,人工抗原在1545 cm-1处的伯胺基吸收峰明显降低,且OA内酯环在载体蛋白的作用下于1589 cm-1处出现一个小而尖锐的峰；在荧光光谱中,OA对人工抗原中载体蛋白在340 nm处的特征峰产生强烈的猝灭作用,并通过同步荧光进一步分析,OA对酪氨酸残基和色氨酸残基皆有猝灭作用,且人工抗原中两种残基的荧光峰位都有小幅度的蓝移,说明偶联后其极性降低,疏水性增强。以上结果均表明,OA与载体蛋白成功的通过活性酯法发生了偶联。另外,通过不同浓度OA与BSA的混合液的荧光光谱分析,对OA与BSA的偶联反应进行进一步探讨,我们发现随着OA浓度的提高,OA对BSA的猝灭作用逐渐加强,但趋势渐缓,且远远不能达到活性酯法制备的免疫原OA-BSA的猝灭程度,而在同步荧光中也证明,混合液中OA只对亮氨酸残基产生了荧光猝灭,这都证明了活性酯法的有效性。人工抗原的圆二色谱中,正峰和负峰强度都明显降低,经过CDSSTR软件分析得知蛋白的α-螺旋含量降低,而β-折叠含量升高,说明其结构更为伸展,更有利于OA暴露于蛋白表面；而混合液中,随着OA浓度的增大,负峰强度逐渐增强,经过CDSSTR软件分析得知,蛋白的α-螺旋含量升高,而β-折叠含量降低,这意味着肽链收缩,蛋白的疏水性增强。人工抗原的荧光光谱和圆二色谱与混合液的显著差别,充分证明人工抗原制备成功。
　　 2抗OA抗血清的制备及其性质研究
　　 以OA-BSA免疫三组BALB/c小鼠,每组三只,免疫抗原剂量皆设定为80μgOA-BSA/次/只,第一组免疫周期为21 d,第二组免疫周期为14 d,第三组免疫周期为7 d。通过抗体生成曲线我们看出,三组小鼠均对OA-BSA产生了免疫应答,第一组和第二组在第三次免疫后抗体产生显著,第四次免疫后抗体产生开始趋于平缓,而第三组在第六次免疫后抗体才明显产生,而第七次免疫后抗体产生开始趋于稳定。对第一组小鼠第三次免疫后、第二组小鼠第四次免疫后以及第三组小鼠第七次免疫后的抗血清进行性质分析,其效价均在105左右。通过方阵实验测得其抗原抗体最佳反应浓度后,采用间接竞争ELISA的方法测定三组小鼠抗血清的灵敏度,发现第一组小鼠确定为第一组小鼠灵敏度在5-7 ng/mL,线性范围在1-10 ng/mL,第二组小鼠灵敏度在13-15 ng/mL,线性范围在1-100 ng/mL,第三组小鼠灵敏度在28-37ng/mL,线性范围在1-100 ng/mL。对小鼠抗血清进行特异性分析,结果显示该抗血清特异性较好,与参试的黄曲霉毒素B1、桔霉素、玉米赤霉烯酮均无交叉反应。
　　 3赭曲霉毒素A的加标回收和实际样品检测
　　 通过icELISA制得了OA抗血清检测OA的ELISA标准曲线,其线性方程为y=-0.1397x+1.9539,R2=0.9937。经ELISA分析,确定OA的平均添加回收率为71.5％-88.2％,变异系数为0.137％-20.56％。在此基础上,将从华中农业大学附近市场购买的若干大米和玉米样品和湖北省农业科学院惠赠的样品进行实际样品检测,部分样品中有可检出OA。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

第一章 文献综述

1 赭曲霉毒素A的产生

1.1 赭曲霉毒素A的主要产毒菌株

1.2 赭曲霉毒素A对食物的污染

2 赭曲霉毒素A的理化性质

3 赭曲霉毒素A的危害

3.1 赭曲霉毒素A的毒性

3.2 赭曲霉毒素A的限量标准

4 赭曲霉毒素A的检测方法

4.1 薄层色谱层析法

4.2 高效液相色谱法

4.3 酶联免疫吸附法

4.4 其他检测方法

5 研究目的和意义

第二章 赭曲霉毒素A完全抗原的构建与鉴定

1 材料

1.1 主要试剂

1.2 主要仪器

2 方法

2.1 OA与BSA的偶联

2.2 OA与OVA的偶联

2.3 人工抗原的光谱学分析

3 结果与分析

3.1 OA-BSA(OVA)的制备

3.2 紫外-可见光谱分析

3.3 红外光谱分析

3.4 荧光光谱分析

3.6 人工抗原的圆二色谱分析

4 小结与讨论

4.1 小结

4.2 讨论

第三章 抗OA多克隆抗体的制备及性质分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 EIASA相关试剂的配制

2 方法

2.1 动物饲养及处理

2.2 免疫方法

2.3 多克隆抗体(抗血清)的制备及分析

3 结果与分析

3.1 抗血清产生进程

3.2 间接非竞争ELISA法检测抗体的效价

3.3 抗OA抗血清的间接竞争ELISA灵敏度分析

4 小结与讨论

4.1 小结

4.2 讨论

第四章 OA的加标回收和实际样品检测

1 材料

1.1 主要仪器

1.2 主要试剂

1.3 实验材料

2 方法

2.1 ELISA标准曲线的建立

2.2 加标回收率的测定

2.3 常见农产品中OA的检测

3 结果与分析

3.1 ELISA标准曲线

3.2 加标回收率的测定

3.3 常见农产品中OA的检测

4 小结与讨论

4.1 小结

4.2 讨论

第五章 总结与展望

1 总结

1.1 赭曲霉毒素A人工抗原的合成

1.2 人工抗原的鉴定

1.3 抗OA多克隆抗体的制备及性质研究

1.4 OA的加标回收和实际样品检测

2 展望

2.1 关于人工抗原的鉴定分析

2.2 关于单克隆抗体

参考文献

致谢

附1攻读硕士学位期间发表的论文