腺病毒转染蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1基因对人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤生长与分化影响的实验研究

摘要

结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤(Extranodal NK/T cellLymphoma，nasallype，ENKTCL-N)是一类具有特殊形态学、免疫表型和生物学行为的侵袭性淋巴瘤，新版WHO关于淋巴造血组织肿瘤的分类(2001)己将其列为一个独立的淋巴瘤类型。在不同国家和地区，该肿瘤占非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymplaomas，NHL)的比例有所差异，总的来说，西欧和北美地区少见，而亚洲和南美洲地区发病率较高[1-3]。四川大学华西医院病理科每年诊断该类肿瘤60余例，约占所有淋巴瘤的13.85％，占非霍奇金淋巴瘤的16％[2,4-5]。国内外研究表明，大多数肿瘤细胞系和组织中发现蛋白酪氨酸磷酸酶-1(SH2domain-containing protein tyrosine phosphates，SHP-1)表达减少或缺失[6-7]，同时将该基因转移入相应的细胞系诱导SHP-1蛋白表达增加，可抑制肿瘤细胞的生长，故近年来该基因被认为是重要的肿瘤候选抑癌基因之一。2001年Oka等[6]首先发现在NK/T细胞淋巴瘤细胞株NK-YS和肿瘤组织中SHP-1基因mRNA明显下调，蛋白表达缺失，认为作为一肿瘤抑制基因，SHP-1蛋白的表达缺失可能在结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤发生中起着重要的作用。 SHP-1属蛋白酪氨酸磷酸酶家族，主要表达于人体各种造血细胞，是控制淋巴细胞间信号传导通路中磷酸化酪氨酸水平的重要负调节因子，与细胞的生长、分化、信号转导和细胞周期调控等有着密切的联系[8]。SHP-1可以和多种信号分子结合，例如T细胞受体(T cell receptor，TCR)、Zeta链相关蛋白-70(zeta chain associated protein．70，ZAP70)、CD3、CD5，B细胞受体(B cell receptor，BCR)、CD22，NK细胞的抑制性受体(Killer cell Inhibitory Receptor，KIR)等，负调节这些分子，即在信号传导早期发挥抑制效应[9-10]。本课题组前期完成SHP-1基因在人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤中表达的研究，发现SHP-1 mRNA明显下调，SHP-1蛋白表达缺失，提示SHP-1基因可能与该肿瘤的发生有关[11-12]。将正常的SHP-1 cDNA转移入肿瘤细胞，是否会对结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤肿瘤细胞的生长与分化产生影响?尚未见相关研究报道。在前期工作的基础上，本实验构建带有SHP-1基因的重组腺病毒，用重组腺病毒转染人结外鼻型NK/T 细胞淋巴瘤细胞系和动物模型移植瘤，旨在了解重组腺病毒转染对人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤生长和分化的影响，初步探讨SHP-1基因与人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤发生与演进的可能关系。 材料与方法: 本研究尝试： 1．从健康人外周血淋巴细胞cDNA中扩增SHP-1基因，构建SHP-1基因重组腺病毒； 2．用重组腺病毒转染人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤细胞系SNK-6和SNT-8，用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time quantity PCR，RQ-PCR)技术检测SHP-1 mRNA、Western blot方法检测SHP-1蛋白以及磷酸化ZAP70蛋白，了解重组腺病毒转染对细胞系SHP-1基因表达水平的影响；绘制细胞系生长曲线，了解腺病毒转染对细胞系生长的影响；流式细胞术(Flowcytometry，FCM)检测细胞周期及细胞免疫表型，了解腺病毒转染对肿瘤细胞增殖与分化的影响； 3．用重组腺病毒转染人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤动物模型移植瘤，用RQ-PCR方法检测SHP-1 mRNA、Western blot方法检测SHP-1蛋白，了解重组腺病毒转染对移植瘤SHP-1基因表达水平的影响；绘制动物模型移植瘤生长曲线，了解重组腺病毒转染对移植瘤生长的影响；免疫组织化学方法(Immunohistochemistrv，IHC)和流式细胞术检测肿瘤细胞免疫表型，了解重组腺病毒转染对肿瘤细胞分化的影响。 结果: 1. 利用AdEasy-1系统成功构建SHP-1基因重组腺病毒Ad-SHP1，病毒滴度高，转染效率较高。 2．重组腺病毒Ad-SHP1转染人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤细胞系SNK-6和SNT-8，随着转染时间的延长，SHP-1 mRNA及蛋白表达水平逐渐增加，磷酸化ZAP70蛋白表达逐渐减少，两株细胞的生长均受到抑制，SNK-6细胞株增殖降低，肿瘤细胞免疫表型表达发生明显变化，多数细胞有向较成熟分化的趋势，少数细胞呈去分化； 3．重组腺病毒Ad-SHP1转染人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤动物模型，肿瘤细胞SHP-1 mRNA和蛋白表达未见统计学差异，但重组腺病毒转染组SHP-1蛋白表达呈一升高趋势，并且移植瘤生长受到抑制，肿瘤细胞免疫表型发生明显变化，多数细胞有向较成熟分化的趋势，少数细胞呈去分化。 结论:本研究用腺病毒转染人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤细胞系和动物模型，结果提示SHP-1基因可能在人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的肿瘤细胞生长与分化中起着一定作用，推测其作用环节是抑制细胞信号传导通路中激活效应蛋白的活性，从而抑制激活信号的持续下传，在人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤SHP-1蛋白的缺失使这种抑制效应解除，导致激活信号的下传，最终引起细胞失控性生长，在其它因素共同作用下导致肿瘤的发生。目前，国内外尚未见类似研究报道。

目录

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分蛋白酪氨酸磷酸酶基因SHP-1重组腺病毒的制备

材料

方法

结果

讨论

小结

第二部分重组腺病毒Ad-SHP1转染对人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤细胞系生长与分化影响的实验研究

材料

方法

结果

讨论

小结

第三部分重组腺病毒Ad-SHP1转染对人结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤动物模型肿瘤生长与细胞分化影响的实验研究

材料

方法

结果

讨论

小结

结论

全文总结

参考文献

综述 蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1与肿瘤的研究进展

个人介绍

致谢

附录