载蛋白三甲基壳聚糖纳米粒口服给药系统的研究

摘要

三甲基壳聚糖(TMC)是壳聚糖的季铵盐衍生物，与壳聚糖仅在酸性pH条件下具有水溶性相比，TMC在更广的pH值范围内都具有良好的水溶性。同时，由于壳聚糖在肠道碱性pH值条件下失去电荷，降低了其促吸收作用，而TMC在碱性条件下仍然带有高密度的正电荷，因此具有更好的促吸收作用。 可生物降解纳米粒具有在胃肠道内保护药物不被降解、提高药物的跨膜转运及M细胞的胞吞作用、缓释或控释药物等优点，这些优点使其成为蛋白质口服给药系统的优良载体。同时，三甲基壳聚糖纳米粒可以通过离子交联法制备，此法制备条件温和，无需使用有机溶剂，因此可以在制备过程中最大程度的保持蛋白质和疫苗的活性。 本课题以三甲基壳聚糖为载体材料，选取两种模型蛋白及一种疫苗药物，制备了载蛋白三甲基壳聚糖纳米粒，并考察其作为口服蛋白给药系统的可行性。以两种具有相似分子量、但不同等电点的模型蛋白-牛血清白蛋白(BSA)及牛血红蛋白(BHb)，考察了TMC纳米粒对具有不同等电点的蛋白质的载药能力和药物释放规律，以及TMC季铵化度对其载药和释放规律的影响。并且利用Caco-2细胞模型对其促进药物透过和吸收的能力进行研究。同时，以一种治疗幽门螺杆菌感染的疫苗药物-尿素酶为模型药物，考察了TMC纳米粒作为口服疫苗载体的免疫加强作用。首先，以壳聚糖为原料，通过一步和二步合成的方法制备TMC。改变合成反应的步骤和反应时间，制备了不同季铵化度的TMC。研究发现，制得的TMC在酸性和碱性条件下均具有良好的水溶性。通过离子交联法制备了TMC纳米粒(TMCNP)，结果显示，交联剂三聚磷酸钠(TPP)的浓度过高或过低均无法制得纳米粒胶体溶液。TMCNP溶液的pH值和TMC成球率均随TPP浓度的增加而升高。同时，TMC的季铵化度对TMCNP的性质也有影响。当TPP浓度保持同一水平时，TMCNP溶液的pH值随TMC季铵化度的升高而降低，TMC成球率的成球率则呈下降趋势。 以两种具有不同等电点的蛋白质药物一牛血清白蛋白(BSA)及牛血红蛋白(BHb)为模型药物，考察了TMCNP对不同蛋白质的载药能力，及体外释放性质。结果表明，以方法A制备的TMCNP对BSA的包封率较高(95％)，而对BHb的包封率则较低(30％)。TMCNP的粒径和zeta电位受BSA浓度的影响较大，但几乎不受BHb浓度的影响。使用季铵化度较低的TMC制备的纳米粒粒径较大，zeta电位较低，且药物的释放也较慢。以方法B制备的BSA-TMCNP经海藻酸钠(SL)修饰，所得纳米粒的粒径减小、zeta电位降低，且BSA的突释明显降低。使用方法C，即将BHb先溶于TPP溶液以获取负电荷后再制备TMCNP，可显著增加包封率，且对药物的体外释放规律无影响。 利用Caco-2细胞模型研究了TMCNP的促吸收作用。结果显示，不论是未修饰的TMCNP还是SL修饰的TMCNP都能够提高药物的跨膜吸收，打开细胞间紧密连接，促进药物的细胞旁路转运。海藻酸钠修饰的TMCNP比未修饰的TMCNP具有更高的透过效率。但海藻酸钠对TMCNP降低TEER及促进药物细胞旁路转运的作用几乎没有影响。 最后，还研究了将TMCNP应用于口服免疫的可行性。以尿素酶为模型药物，对尿素酶TMCNP制备工艺进行了初步的筛选。皮下注射TMCNP免疫的小鼠产生了最高的系统免疫反应(IgG水平)，但同时其产生的粘膜反应却最弱(分泌型IgA水平)。相比之下，口服TMCNP免疫的小鼠表现出了比口服TMC溶液免疫及口服尿素酶溶液免疫的小鼠更高的IgG和S-Igh水平。这些结果都表明TMCNP能够被用于口服蛋白及疫苗给药系统的构建。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分三甲基壳聚糖的合成及其纳米粒的制备

1.仪器与试药

2.实验方法

2.1.TMC的合成

2.2.TMCNP的制备

2.3.交联剂（TPP）浓度对TMCNP溶液的PH值及TMC成球率的影响

3.结果与讨论

3.1.TMC的季铵化度计算结果

3.2.壳聚糖和TMC在不同PH值的水溶液中的溶解行为比较

3.3.TMCNP的制备

4.本部分小节

参考文献

第二部分三甲基壳聚糖纳米粒的载药与体外释放性质初探

1.仪器与试药

2.实验方法

2.1.牛血清白蛋白、牛血红蛋白含量测定方法的建立

2.2.载药TMCNP的制备

2.3.TMCNP的形态学观察及粒径、ZETA电位的测定

2.4.TMCNP的包封率及载药量的测定

2.5.TMCNP体外释药规律的研究

3.结果与讨论

3.1.牛血清白蛋白、牛血红蛋白含量测定方法的建立

3.2.TMCNP的形态学观察

3.3.TMCNP的ZETA电位和粒径

3.4.TMCNP的包封率和载药量

3.5.制备方法对TMCNP的影响

3.6.TMCNP体外释药规律的研究

4.本部分小结

参考文献

第三部分三甲基壳聚糖纳米粒的促细胞透过作用研究

1.仪器与试药

2.试验方法

2.1.FITC-BSA的合成与纯化

2.2.FITC-BSA含量测定方法的建立

2.3.荧光黄(LUCIFER YELLOW LY)含量测定方法的建立

2.4.载药TMCNP的制备及理化性质的测定

2.5.CACO-2细胞试验

3.结果与讨论

3.1.FITC-BSA含量测定方法的建立

3.2.LY含量测定方法的建立

3.3.载FITC-BSA的TMCNP的制备及理化性质的测定

3.4.CACO-2细胞透过实验

4.本部分小结

参考文献

第四部分尿素酶三甲基壳聚糖纳米粒的制备及免疫学性质研究

1.仪器与试药

2.试验方法

2.1.尿素酶测定方法的建立

2.2.尿素酶TMCNP制备工艺的初步考察

2.3.尿素酶TMCNP口服免疫小鼠实验

3.结果与讨论

3.1.尿素酶测定方法的建立

3.2.尿素酶TMCNP制备工艺的初步考察

3.3.尿素酶TMCNP口服免疫小鼠实验

4.本部分小结

参考文献

全文结论

综述 口服疫苗给药系统的研究进展

致谢