恒河猴肝脏cDNA文库构建及部分凝血相关因子的遗传分子研究

摘要

恒河猴(Macaca mulatta)是在进化亲缘关系上仅次于黑猩猩和人的灵长类动物，广泛应用于生物医学研究的各个领域。随着移植科学的发展，猪—恒河猴移植已成为了猪—人异种移植研究中重要的动物模型，但由于猴与人仍然存在一定的进化差异，猪到猴异种移植的实验结果是否也同样真实反映了猪的异种器官组织在人体内的情况是非常值得关注的问题。动物模型研究发现凝血紊乱是目前阻碍异种移植的最大障碍之一，其主要原因可能是超急性排斥引起的免疫损伤和供受者凝血系统分子不匹配，但具体机制还不清楚。因此，深入了解恒河猴凝血相关基因的特点和遗传背景，比较恒河猴凝血系统与人和猪的差异，有助于更加有效地建立动物模型，研究异种移植凝血紊乱的机制以及可能的防治措施，更准确地理解和应用恒河猴动物模型的实验结果，使安全有效的异种移植真正走向临床应用。 cDNA文库的构建是分子生物学领域的一项重要技术，应用cDNA文库筛选和克隆新基因，是一条快速而有效的途径。但如何快速高效地建立高质量的cDNA文库，并从中获得有关目的基因的序列信息，需要具备一定的方法学基础。首先，我们分别使用λZAP Express载体和λTripIEx2载体构建版纳微型猪(Banna Minipig Inbred line，BMI)外周血淋巴细胞cDNA文库，在此基础上对建库方法加以改进，建立了简便、快速和高质量的λZAP Express cDNA文库构建方法，成功构建了BMI肝脏cDNA文库。其次，我们使用PCR和噬菌斑杂交技术，通过从BMI肝脏cDNA文库中筛选凝血因子Ⅶ阳性克隆，建立了适合本实验室的cDNA文库筛选方法。凝血系统中的大部分凝血因子均由肝脏合成，为了研究恒河猴凝血相关基因，我们使用λZAP Express为载体成功构建了恒河猴肝脏cDNA表达文库，初级文库的库容量为1.2×10<'6>个克隆，扩增文库的滴度为7.7×10<'9>个克隆/ml，重组率为99％。cDNA文库中克隆的cDNA平均长度约为2.5kb，能满足今后进一步研究的需要。 凝血因子(coagulation factor,CF)Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ，抗凝血酶Ⅲ(antithrombinⅢ，AT-Ⅲ)是凝血、抗凝和纤溶系统中的重要因子。我们通过PCR方法对恒河猴肝脏cDNA表达文库进行筛选，获得含恒河猴AT-Ⅲ、CFⅡ、CFⅦ和CFX基因cDNA的阳性克隆，再结合5'RACE技术，获得AT-Ⅲ、CFⅡ、CFⅦ和CFX四个基因的全长cDNA序列，分别为1545bp、2029bp、2424bp和1683bp，提交GenBank后获得序列编号分别为：EF057492、EF057490、EF061407和EF057491。 我们利用生物信息学方法对恒河猴AT-Ⅲ,CFⅡ、CFⅦ和CFX核酸及蛋白质序列进行了初步分析，并通过与人、猪相应序列的同源性比对和蛋白模拟三维结构的比较，初步分析了恒河猴与人、猪凝血因子的相似性和可能存在的差异。结果显示：恒河猴AT-Ⅲ、CFⅡ、CFⅦ和CFX与人相应基因比较，核酸序列相似性分别为95.22％、95.72％、91.65％和94.68％，氨基酸序列相似性分别为96.01％、91.11％、89.83％和93.65％；与猪相应基因比较，核酸序列相似性分别为89.33％、86.14％、76.71％和76.63％，氨基酸序列相似性分别为89.33％、89.03％、70.61％和72.02％。序列比对提示三个物种对应的凝血因子都有相同的结构域，所有的半胱氨酸位点在不同的物种间都高度保守，主要催化活性位点在序列和空间位置上也都高度保守，但在一些大分子识别结合位点或其他功能位点上三者间仍存在差异，如：糖基化位点、磷酸化位点和酶切位点等。猴、猪、人相应凝血因子蛋白质的三维结构中，蛋白骨架的空间构象都非常相似，提示这些凝血因子在三个物种间具有相似的生理功能和催化活性，但在一些特殊位点的序列差异可能造成空间构象和空间位阻的变化，在和底物结合以及其他大分子结合的能力上产生差异。为了进一步验证克隆得到的恒河猴凝血因子cDNA序列的正确性，并为今后大量制备恒河猴凝血因子用于深入的体内外比较研究，我们分别构建了恒河猴AT-Ⅲ基因原核表达载体pET-22b/mAT-Ⅲ、pET-DsbA/mAT-Ⅲ、真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)/mAT-Ⅲ及毕赤酵母重组表达载体pPIC9K/mAT-Ⅲ，尝试了应用这三种不同的表达系统对恒河猴AT-Ⅲ基因进行体外蛋白表达，在毕赤酵母中得到了有活性的表达蛋白，为今后其他恒河猴凝血因子的重组制备打下了基础。 综上所述，本研究建立了适合本实验室的cDNA文库构建和筛选方法；成功构建了恒河猴肝脏cDNA表达文库；克隆得到了重要的凝血相关因子AT-Ⅲ、CFⅡ、CFⅦ和CFX的全长cDNA序列；通过生物信息学方法初步比较了恒河猴凝血因子在基因序列和蛋白质空间结构上与人和猪的差异；对恒河猴AT-Ⅲ基因的体外表达进行了初步研究，获得了有生物活性的表达产物，证实了其全长cDNA基因序列的真实性。为异种移植模型的建立和应用，为保护、开发和应用我国恒河猴资源提供遗传学依据。

目录

论文说明：主要中英文对照

声明

前言

第一部分cDNA文库构建及筛选方法的建立

1前言

2材料与方法

3实验结果

4讨论

5结论

附录1：cDNA文库构建方法

附录2：cDNA文库筛选方法

附图

第二部分恒河猴肝脏cDNA文库的构建及凝血相关部分基因的克隆

1.前言

2.材料与方法

3.实验结果

4.讨论

5.结论

附图

第三部分恒河猴凝血相关因子AT-Ⅲ、CFⅡ、CFⅦ、CFX的全长cDNA克隆及生物信息学分析

1前言

2材料与方法

3实验结果

3讨论

5结论

附图1

附图2

第四部分 恒河猴抗凝血因子Ⅲ(Mat-Ⅲ)基因体外表达的初步研究

1前言

2材料与方法

3实验结果

4讨论

5结论

附图1

附图2

全文总结

参考文献

综述 恒河猴主要组织相容性复合物（MHC）基因研究进展

个人简历

致谢

发表论文一

发表论文二

发表论文三

发表论文四

发表论文五