穴位埋线治疗变应性鼻炎的临床疗效和安全性评价及相关机制的动物实验研究

摘要

目的：评价穴位埋线治疗变应性鼻炎（Allergic Rhinitis，AR）的临床疗效和安全性，探讨穴位埋线对变应性鼻炎机体鼻黏膜神经源性炎症及免疫相关基因表达谱的调节作用，从临床和基础两方面为为穴位埋线治疗AR的临床运用提供科学依据。
　　方法：①采用随机、盲法、对照的临床研究方法，通过EXCEL软件RAND函数产生随机数字，将符合纳入标准的128名AR受试者分为A组（穴位埋线组）和B组（穴位假埋线组）。两组均采用相同的取穴方案，每位受试者共接受两次穴位埋线/假埋线治疗，两次治疗间隔2周。以视觉模拟评分量表（visual analogue scale，VAS）积分及鼻眼结膜相关生活质量问卷调查量表（Rhinocoujunctivitis Quality of Life Questionaire）（中文版自测版本）积分为主要的疗效评价指标，以鼻内镜检查，以及血清特异性IgE、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ及VCAM-1等实验室检测指标作为第二疗效评价指标，治疗期间的合并用药情况、受试者的不良反应也将被记录。在治疗前、治疗结束后4周（血清学指标该时间点未行检测）、治疗后8周不同时间点随访受试者，评价穴位埋线/假埋线的临床疗效及安全性。②以卵清蛋白致敏SD大鼠的方法制作变应性鼻炎动物模型,分为治疗组A和对照组B，另设空白组C。每组各15只SD大鼠。A组迎香穴（LI20）埋线，B组不行任何治疗。A组大鼠行迎香穴穴位埋线治疗。治疗后10天，同时取各组大鼠鼻黏膜组织，行HE染色及感觉神经肽—P物质(substance P,SP)、降钙素基因相关肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）和神经激肽A(neurokinin A，NKA）的免疫组织化学染色。观察以下内容：造模及治疗期间大鼠变应性鼻炎相关的行为学评分变化；光镜下每张切片以嗜酸性粒细胞浸润情况为主的炎症病变情况；感觉神经肽免疫组化染色情况及积分光密度值（iOD）的测定情况。③采用方法2中同样的造模、分组及干预方法，每组SD大鼠各3只。A组大鼠第二次迎香穴埋线后取各组大鼠鼻黏膜，经RNA抽提、纯化、质量检测、cDNA合成后，以第二代功能分类 Real-time PCR芯片----The Rat Inflammatory Response&Autoimmunity RT2 Profiler?PCR Array（含84个目标基因）研究穴位埋线治疗后鼻黏膜免疫相关基因表达谱的改变情况，并以ΔΔCt方法进行三组间两两比较的数据分析。
　　结果：⑴2组受试者的人口学特征、生命体征、病史病情等基线资料具有可比性。⑵VAS量表评价结果显示：2组受试者穴位埋线/假埋线在治疗后4周、治疗后8周与治疗前相比，差异具有统计学意义（P＜0.001）。而两组受试者间横向比较，在治疗后4周无组间差异(P=0.753)，治疗后8周组间的差异具有统计学意义(P＜0.05）。⑶RQLQ问卷调查表的结果显示：2组受试者穴位埋线/假埋线在治疗后4周、治疗后8周与治疗前相比，差异具有统计学意义（P＜0.001）。且两组受试者间横向比较，在治疗后4周、治疗后8周组间的差异均具有统计学意义(P＜0.05）。⑷鼻内镜检查结果：2组受试者鼻黏膜颜色的变化，治疗后4周与治疗前相比，差异无统计学意义(P=0.470)；但治疗后8周与治疗前相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。鼻分泌物、下鼻甲大小，2组治疗后4周及治疗后8周行自身前后对照，差异均有统计学意义（P＜0.01）。2组受试者的组间横向比较，下鼻甲大小及鼻分泌物评分项，在治疗结束后4周、8周，A、B两组间的差异均有统计学意义（P＜0.05），但鼻黏膜颜色项，在各疗效评价点的组间差异无统计学意义（P＞0.200）。⑸实验室检测指标：组内自身前后对照，A、B组的血清特异性 IgE在治疗前后的差异有统计学意义（P＜0.05），而其余指标的变化在治疗前后无统计学差异（P＞0.100）。组间横向比较，A、B组间的血清特异性 IgE在治疗前及治疗后的组间差异均具有统计学意义；而其余实验室检测指标在治疗前、治疗后8周两个时间点的组间差异无统计学意义（P＞0.05）。⑹对大鼠变应性鼻炎相关的行为学评分的影响：对组间喷嚏、流涕、抓挠单个条目分别进行单因素方差分析，按照α=0.05的检验水准，三组间变应性鼻炎行为学的差异有统计学意义（P≤0.01）。以LSD法行组间两两比较时，行为学评分的差异均有统计学意义（P＜0.05）。⑺鼻黏膜HE染色结果：光镜下，变应性鼻炎对照组(B组)鼻黏膜纤毛倒伏、脱落，查见大量嗜酸性粒细胞及少量淋巴细胞浸润。穴位埋线组（A组）少量上皮脱落，腺体轻度增生，炎症反应较B组有所减轻。空白组(C组)纤毛整齐无脱落，未见明显嗜酸性粒细胞及异染细胞浸润。⑻感觉神经肽免疫组化及积分光密度值测定结果：A、B、C三组大鼠鼻黏膜的SP、CGRP、NKA的免疫组化染色均呈现出了B组鼻黏膜细胞内棕黄色阳性颗粒较多，甚至成片分布；A组次之；C组最少的趋势。积分光密度值经两两比较，差异均具有统计学意义（P＜0.001）。⑻本研究提取的9个样本提取的鼻黏膜RNA合符要求。⑽PCR检测中扩增曲线中大部分Ct值均在20～35范围内，曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显，基线平而无上扬现象，各孔的扩增曲线平行性好，表明各反应管的扩增效率相近。扩增曲线的结果表明该 PCR反应体系和反应程序设置合理。⑾各样本每个PCR产物的熔解曲线均为单峰，表示扩增产物单一，无非特异性扩增产物。⑿B组的检测值（2^-ΔCt）与A组检测值（2^-ΔCt）相比，在这些免疫反应相关基因中，有2个上调基因，这2个基因的组间差别无统计学意义；下调倍数大于3或下调倍数具有统计学意义的基因有基因有17个，其中组间差异具有统计学意义的下调基因有10个。⒀C组的检测值（2^-ΔCt）与B组检测值（2^-ΔCt）相比，得出:在这些免疫反应相关基因中，无上调基因；下调倍数大于3基因有23个，这些基因的组间差异均无统计学意义。⒁C组的检测值（2^-ΔCt）与A组检测值（2^-ΔCt）相比，得出:在这些免疫反应相关基因中，无上调基因；下调倍数大于3的基因有44个，其中9个下调基因的组间差异有统计学意义。
　　结论：①穴位埋线及假埋线均有助于改善变应性鼻炎患者的症状（VAS评分）及相关的生活质量（RQLQ评分）。但穴位埋线组由于有埋入线体的持续刺激，该组受试者的症状（VAS评分）及相关的生活质量（RQLQ评分）改善较假埋线组更持久。穴位埋线也有助于改善受试者的鼻黏膜颜色、鼻分泌物、下鼻甲的肿胀情况，以及受试者治疗前后血清特异性 IgE的表达情况，但对参与免疫反应的其他细胞因子无改善作用。②穴位埋线可能通过改善感觉神经肽参与的鼻腔神经源性炎症而减轻变应性鼻炎的状况。但穴位埋线治疗的AR大鼠模型组，经治疗，症状虽较治疗前缓解，但与空白组相比，组间感觉神经肽的表达差异仍有统计学意义，提示虽然没有明显症状，但是黏膜的炎症状态仍在持续。③利用功能性分类基因芯片技术有的放矢地对穴位埋线治疗的变应性鼻炎动物的鼻黏膜的免疫相关基因表达谱进行差异表达基因的筛选是可行的。与全基因表达谱芯片的研究相比，该方法能够更为快速、准确地筛选出目标基因，进而为穴位埋线治疗变应性鼻炎的治疗方法提供理论依据，并为进一步的研究指明方向。

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中英文缩略词表

目录

第一部分 穴位埋线治疗疗变应性鼻炎的临床疗效及安全性评价研究

一 引 言

二 研究方法

三 研究结果

四 讨论

五 结论

六 问题与展望

第二部分 穴位埋线对变应性鼻炎SD大鼠鼻黏膜神经源性炎症的调节作用

一 引 言

二 研究方法

三 研究结果

四 讨论

五 结论

六 问题与展望

第三部分 利用功能分类基因芯片技术研究穴位埋线对变应性鼻炎大鼠免疫相关基因的调节作用

一 引 言

二 研究方法

三 结果

四 讨论

五 结论

六 问题与展望

参考文献

致谢

附件

附件一 本次临床研究的试验方案（英文）、系统评价（英文）及综述

附件二：在读期间公开发表的学术论 文、专著及科研成果

附件三：申明及授权书