构建含6-磷酸葡萄糖脱氢酶和半胱氨酸合成酶的重组大肠杆菌及其钴吸附研究

摘要

6-磷酸葡萄糖脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，g6pd)是可产生还原力的磷酸戊糖途径的限速酶，半胱氨酸合成酶（Cysteine synthase，cys）参与生物体抗逆代谢中重要前体物质半胱氨酸的合成，这两个基因的协同作用维持生物体的还原状态，增强抗逆代谢。论文利用基因工程技术手段将沼泽红假单胞菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因和半胱氨酸合成酶基因重组到大肠杆菌中，研究其提升重组基因工程菌株耐受和对重金属离子的吸附。论文研究了g6pd和cys基因的扩增和分析;构建含6-磷酸葡萄糖脱氢酶和半胱氨酸合成酶的双元表达载体，获取重组基因工程大肠杆菌;通过诱导表达，筛选重组基因工程大肠杆菌。并考察其对钴离子的吸附，研究重组蛋白对其耐受能力的提升。
　　论文主要取得以下结果:
　　1.在NCBI数据库上查找到沼泽红假单胞菌6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因和半胱氨酸合成酶基因序列，设计出引物，通过PCR扩增，测序，用DNAman分析基因同源性和氨基酸组成，并用SWISS-MODEL模拟了两个基因对应蛋白质的三维结构。结果表明:扩增得到沼泽红假单胞菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因和半胱氨酸合成酶基因;氨基酸序列和蛋白质构象分析表明6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因表达的蛋白质含有504个氨基酸，大小为55.99kDa，半胱氨酸合成酶编码蛋白质含有332个氨基酸，大小为34.55kDa。
　　2.分别设计含酶切位点的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因(BamHⅠ、HindⅢ)和半胱氨酸合成酶基因(NdeⅠ、KpnⅠ)扩增引物，扩增后与克隆载体pBM20-T连接得到克隆重组质粒;扩增回收的产物与双元表达载体pETDuet-1质粒连接，构建含6-磷酸葡萄糖脱氢酶和半胱氨酸合成酶的双元表达质粒载体pETD-GC;然后将该质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得了含6-磷酸葡萄糖脱氢酶和半胱氨酸合成酶基因的重组大肠杆菌。
　　3.基因工程菌株通过IPTG诱导表达，筛选出能正确表达的BL-GC，考察其在不同pH、温度和Co2+初始浓度等条件下对Co2+的吸附，研究BL-GC的耐受性。结果表明:BL-GC菌较适宜的吸附条件为pH=6.5，温度为30℃，Co2+浓度为60mg/L，这个条件下培养15小时吸附率可达39.7％，菌株BL-GC的吸附能力较BL21(DE3)提高了3倍，而当Co2+浓度达到120mg/L时，BL-GC仍可继续生长，吸附可达31.6％。从BL21(DE3)和BL-GC两株菌的生长曲线，发现质粒的转入导致了BL-GC的生物量略低于BL21(DE3)，而BL-GC的吸附比宿主菌株更高，说明重组转入的沼泽红假单胞菌6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因和半胱氨酸合成酶基因在诱导表达后成功提升了宿主菌株的抗逆能力。

目录

声明

摘要

第1章 前言

1．1 重金属污染

1．2 生物吸附法

1．2．1 植物原位修复

1．2．2 微生物修复

1．3 微生物对重金属吸附的机制

1．4 基因工程菌吸附重金属研究

1．4．1 基因工程菌对重金属的吸附

1．4．2 半胱氨酸合成途径和磷酸戊糖途径响应重金属吸附研究

1．5 技术路线

1．6 论文的目的和意义

第2章 沼泽红假单胞菌cys基因和g6pd基因克隆

2．1 试剂与仪器

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要仪器

2．1．3 培养基配方

2．2 方法

2．2．1 沼泽红假单胞菌总DNA提取

2．2．2 沼泽红假单胞菌cys基因和g6pd基因的克隆

2．3 结果与讨论

2．3．1 沼泽红假单胞菌活化培养与总DNA提取

2．3．2 cys基因和g6pd基因的克隆

2．3．4 cys基因和g6pd基因测序结果和分析

2．3．5 小结与讨论

第3章 含cys基g6pd基因的重组大肠杆菌构建和筛选

3．1 试剂与仪器

3．1．1 试剂与菌种

3．1．2 主要仪器

3．1．3 培养基及其他试剂配制

3．2 实验方法

3．2．1 耐受增强质粒pETD-GC的构建

3．2．2 重组耐受大肠杆菌的筛选

3．3 结果与讨论

3．3．2 cys基因和g6pd基因的双酶切反应

3．3．3 pETD-GC载体构建

3．3．4 pETD-GC测序结果

3．4 小结与讨论

第4章 含cys和g6pa基因的重组大肠杆菌表达及其钴吸附研究

4．1 试剂与仪器

4．1．1 试剂与菌种

4．1．2 主要仪器

4．2 溶液配制

4．2．1 培养基

4．2．2 SDS-PAGE相关试剂

4．2．3 PBS缓冲液配方

4．3 实验方法

4．3．1 G6PD和CYS蛋白的表达

4．3．2 钴耐受重组大肠杆菌吸附钴的条件优化

4．4 结果与讨论

4．4．1 G6PD和CYS蛋白的表达

4．4．2 钴耐受重组大肠杆菌吸附钴的条件优化

4．4．3 小结与讨论

结论

致谢

参考文献

在读期间发表的学术论文与研究成果

附录