黑曲霉木聚糖酶在同源宿主中的分泌性表达及酶学特性研究

摘要

木聚糖酶（Xylanase），又称β—D—1，4—内切木聚糖酶，是降解木聚糖的关键酶，它能水解木聚糖主链上的β—1，4—糖苷键，将木聚糖降解为低聚糖和木糖，广泛应用于饲料、造纸和食品医药等行业，具有广阔的应用前景。但木聚糖酶的单位产量较低，是限制木聚糖酶应用的主要因素之一。本研究应用同源高效表达策略，在丝状真菌表达系统中构建高产的黑曲霉木聚糖酶基因工程菌。 本课题首先从黑曲霉菌（Aspergillus niger） TSI菌株中提取总RNA，以其为模板运用RT—PCR的方法成功克隆出678bp的木聚糖酶xynB基因，将该基因片段插入融合蛋白基因表达载体pYG1.2葡萄糖淀粉酶编码基因的下游，融合之处设计内胰蛋白酶（KEX2）加工位点，构建融合表达质粒pYG1.2—xynB。测序结果表明，该木聚糖酶基因序列与A．niger IBT—90木聚糖酶（GenBank accession AY536639）基因序列具有99.4％的同源性，有4个碱基的差异，仅一个碱基的突变导致氨基酸改变，编码的蛋白质序列同源性达99.5％。随后运用原生质体转化法将pYG1.2—xynB转化尿嘧啶缺陷型宿主黑曲霉菌M54，获得重组菌株。SDS—PAGE结果表明，重组木聚糖酶在转化菌株中获得了高效分泌性表达，其分子量约为21KD。在1％木聚糖为诱导物的培养条件下，重组菌分泌的木聚糖酶酶活有明显提高，最高酶活达507IU/ml，分别是原始出发菌和宿主菌的6.7倍和3.89倍。对获得的转化子进行连续传代培养结果表明，重组菌生长特性十分稳定，具有良好遗传稳定性。重组菌最佳产酶时间为培养后72h，最适反应pH为5.2，属酸性木聚糖酶：最适反应温度为50℃，在50℃—60℃之间热稳定性较好，60℃保温30min后残余酶活为63.95％。 本实验首次运用同源表达的策略，将黑曲霉木聚糖酶基因在同源丝状真菌中表达。研究结果表明，木聚糖酶在重组黑曲霉中获得了高效分泌性表达。重组菌发酵周期短，产酶活性高，具有重要的应用前景，为酸性木聚糖酶的广泛应用奠定了一定基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词表

声明

第1章 前言

第2章 仪器和材料

2.1 仪器及物品

2.2 菌株和质粒

2.3 试剂及溶液

第3章 方法

3.1 Trizol提取黑曲霉菌TS1总RNA

3.2 PCR引物设计

3.3 RT-PCR

3.4 质粒pYG1.2的提取

3.5 PCR产物及质粒pYG1.2的双酶切

3.6 酶切产物的连接反应

3.7 Inoue法制备大肠杆菌超级感受态细胞

3.8 重组质粒的大肠杆菌转化

3.9 重组质粒的鉴定

3.10 重组质粒pYG1.2-xynB转化宿主黑曲霉菌M54

3.11 重组木聚糖酶在黑曲霉菌M54中的表达

3.12 SDS-PAGE

3.13 DNS法测定重组木聚糖酶的活性

3.14 重组木聚糖酶酶学特性研究

第4章 结果

4.1 黑曲霉菌TS1总RNA电泳图

4.2 RT-PCR扩增木聚糖酶xynB基因

4.3 融合表达载体的构建

4.4 酶切鉴定pYG1.2-xynB重组质粒

4.5 xynB基因编码序列测序结果

4.6 pYG1.2-xynB重组质粒转化宿主黑曲霉菌M54实验结果

4.7 蛋白表达产物的SDS-PAGE

4.8 重组木聚糖酶活性测定

4.9 重组木聚糖酶酶学性质

第5章 分析讨论

5.1 丝状真菌表达系统

5.2 同源表达策略

5.3 木聚糖酶的诱导表达

5.4 黑曲霉M54原生质体的制备

5.5 重组木聚糖酶酶学性质

第6章 结论

致谢

参考文献

附录A 综述木聚糖酶基因工程研究进展

个人简历在读期间发表的学术论文与研究成果