氨基糖苷类抗生素双功能酶AAC(6’)APH(2’’)的克隆表达及其抑制剂筛选模型的建立

摘要

氨基糖苷类抗生素是目前临床上常用的抗感染药物,由于该类抗生素具有抗菌谱广,疗效好,性质稳定等优势,在市场上占据相当的份额。但是由于临床耐药菌的出现导致其使用受到限制。耐药菌对于氨基糖苷类抗生素的耐药主要是通过合成钝化酶对进入细胞的氨基糖苷类抗生素药物进行修饰而使其失去活性。氨基糖苷类抗生素双功能修饰酶AAC(6’)-APH(2”)在临床耐药菌中分布很广,是造成氨基糖苷类抗生素失活的一个主要因素。
　　 论文的第一部分,我们首先使用检测引物对编码AAC(6’)-APH(2”)的基因进行了检测,证实6株MRSA均携带aac(6’)-aph(2”)基因；然后依照Genebank公布的aac(6’)-aph(2”)全序列设计表达引物,从MRSA中克隆得到了编码双功能修饰酶的aac((6’)-aph(2”)基因,随后将其和pET28a连接并转化入E.Coli BL21(DE3)得到重组表达AAC(6’)-APH(2”)工程菌SIPI—GE1102。表达实验表明,SIPI—GE1102能够产生可溶性AAC(6’)-APH(2”),其在培养温度30℃、IPTG终浓度为0.1mmol／L时,AAC(6’)-APH(2”)的可溶性表达量最大。对纯化后的AAC(6’)-APH(2”)采用抗生素纸片扩散法以及质谱检测法进行体外活性检测,证实所得到的重组AAC(6’)-APH(2”)具有预期的体外催化活性。
　　 论文的第二部分,考察了AAC(6’)-APH(2”)体外反应条件和建立了AAC(6’)-APH(2”)抑制剂体外筛选模型,并通过阳性对照试验证明该模型具有重现性和稳定性。确定了待筛选样品的制备过程:首先取本实验室保藏的1500个植物内生真菌发酵液提取物,用水溶解(加入2％助溶剂DMSO),溶解后的样品用枯草芽孢杆菌做鉴定菌进行敏感性实验,然后选择762个对枯草芽孢杆菌不敏感的样品进行／LAC(6’)-APH(2”)酶抑制剂的筛选。在该筛选模型中,以枯草芽孢杆菌为鉴定菌,以indolicidin为AAC(6’)-APH(2”)的阳性抑制剂,以卡那霉素B为靶标药物。筛选结果表明:在762个筛选样品中,初筛得到18个对AAC(6’)-APH(2”)有抑制活性的样品,复筛后仅有1个样品对AAC(6’)-ALPH(2”)仍保持抑制活性。
　　 通过本论文研究建立的AAC(6’)-APH(2”)抑制剂体外筛选模型,提供了一种筛选氨基糖苷类抗生素钝化酶抑制剂的方法。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写说明

第1章 绪论

1.1 氨基糖苷类抗生素

1.1.1 氨基糖苷类抗生素的概述

1.1.2 氨基糖苷类抗生素的作用机制

1.2 氨基糖苷类抗生素钝化酶

1.2.1 氨基糖苷类抗生素钝化酶的作用机制

1.2.2 氨基糖苷类抗生素钝化酶的临床分布

1.2.3 本课题研究的氨基糖苷双功能酶AAC(6’)-APH(2”)

1.3 寻找氨基糖苷类抗生素钝化酶AAC(6’)-APH(2”)抑制剂的研究进展

1.3.1 根据修饰酶活性位点带电特性设计的抑制肽

1.3.2 根据活性靶点设计的抑制剂

1.3.3 根据酶结构相似性设计的抑制剂

1.3.4 根据已有抗生素结构进行改造的抑制剂

1.4 立题依据

第2章 氨基糖苷类双功能修饰酶AAC(6’)-APH(2”)的克隆、表达、纯化及性质研究

2.1 材料与仪器

2.1.1 菌种

2.1.2 质粒

2.1.3 培养基

2.1.4 主要溶剂和缓冲液

2.1.5 主要试剂

2.1.6 培养基成分

2.1.7 仪器

2.2 实验方法

2.2.1 菌种的培养与保藏

2.2.2 细菌总DNA的制备

2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.4 大肠杆菌质粒转化

2.2.5 大肠杆菌质粒的抽提

2.2.6 aac(6’)-aph(2”)耐药基因的检测

2.2.7 aac(6’)-aph(2”)基因的表达引物设计

2.2.8 aac(6’)-aph(2”)基因的PCR反应扩增

2.2.9 DNA片段的回收

2.2.10 aac(2’)-aph(2”)PCR产物的克隆

2.2.11表达质粒的构建

2.2.12转化子蛋白的试表达

2.2.13转化子蛋白表达诱导条件的摸索

2.2.14 AAC(6’)-APH(2”)的表达与纯化

2.2.15目标蛋白的鉴定

2.2.16蛋白质浓度的检测

2.2.17AAC(6’)-APH(2”)的催化活性检测

2.2.18 AAC(6’)-APH(2”)对于卡那霉素的米氏常数的测定

2.2.19质谱检测

2.2.20分析软件

2.3 结果与讨论

2.3.1 aac(6’)-aph(2”)基因的检测

2.3.2 aac(2’)-aph(2”)基因的PCR扩增

2.3.3 aac(6’)-aph(2”)PCR产物的克隆

2.3.4 aac(6’)-aph(2”)基因序列和其对应氨基酸序列分析

2.3.5 AAC(6’)-APH(2”)的表达载体的构建

2.3.6 转化子蛋白的试表达

2.3.7 转化子蛋白表达诱导条件的摸索

2.3.8.AAC(6’)-APH(2”)的纯化及蛋白浓度检测

2.3.9 AAC(6’)-APH(2”)的体外催化活性的抑菌圈法检测

2.3.10 AAC(6’)-APH(2”)的体外催化活性的质谱检测

2.3.11 AAC(6’)-APH(2”)对于卡那霉素B的米氏常数的测定

2.4 本章小结

第3章 .AAC(6’)-APH(2”)抑制剂筛选模型的建立及筛选

3.1 材料与仪器

3.1.1 菌种

3.1.2 材料

3.1.3 仪器

3.1.4 培养基

3.2 实验方法

3.2.1 菌种的培养与保藏

3.2.2 AAC(6’)-APH(2”)抑制剂筛选模型的建立

3.2.3 AAC(6’)-APH(2”)抑制剂的筛选

3.3 结果与讨论

3.3.1 筛选模型的建立

3.3.2 样品筛选

3.4 本章小结

全文总结

致谢

参考文献

附录

作者简介

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