植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶编码基因的研究

摘要

植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)具有降解亚硝酸盐的能力。根据已知四种类型亚硝酸盐还原酶蛋白序列的保守序列，利用相关蛋白分析软件及生物信息学工具，查找到植物乳杆菌基因组上的亚硝酸盐还原酶疑似基因8个。克隆出全部基因序列，构建表达载体pET-32a(+)-NiRs。将构建成功的质粒转入BL21(DE3)表达菌感受态细胞。经诱导表达后的目的蛋白，按照GENMED公司细菌亚硝酸盐还原酶总活性检测试剂盒说明进行酶活测定。结果发现，植物乳杆菌体内的一未知蛋白hypotheticalprotein(HP)具有显著降解亚硝酸盐的能力，其酶活达到了15.48U/mg(U=μmolnitrite/min)；其中一谷胱甘肽还原酶glutathionereductase(GR)和一氧化还原酶Oxidoreductase(ORD)也有酶活，经计算，其酶活分别为2.49U/mg、3.32U/mg。
　　 通过生物信息学分析，我们发现，HP、GR、ORD蛋白的高级结构均含有α螺旋、无规卷曲、延伸主链三种二级结构，其中HP蛋白的高级结构主要以α螺旋为主，含有α螺旋结构的比例为53.76％；GR蛋白的高级结构主要以无规卷曲为主，含有无规卷曲结构的比例为50.45％；ORD蛋白的高级结构主要也是以无规卷曲为主，含有无规卷曲结构的比例为51.37％；对该三种蛋白的信号肽、跨膜区进行分析，结果表明，三种目的蛋白均无信号肽，也没有跨膜区，故不是分泌蛋白，通过膜泡分泌到胞外的可能性更小。这与这三种蛋白在细胞内的定位预测结果相符，所以推测HP蛋白、GR蛋白和ORD蛋白存在于细胞质中。
　　 为了初步探索植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的类型，我们成功制备出了大肠杆菌NrfA多克隆抗体。根据大肠杆菌亚硝酸盐还原酶NrfA的ORF序列设计引物，通过PCR扩增的方法获得了NrfA基因的完整序列。PCR产物经双酶切后插入到pET-28a(+)载体中，成功的构建了重组质粒pET-28a(+)-NrfA。构建好的表达载体pET-28a(+)-NrfA在大肠杆菌中经诱导后，高效表达NrfA蛋白。经蛋白纯化、免疫新西兰雄兔而制得多克隆抗体。获得的多克隆抗体用ELISA检测，其效价达到了1:102400,经WesternBlotting分析，抗体的特异性较好。我们将大肠杆菌NrfA多克隆抗体在鉴定植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶类型中进行了初步应用，获得与预期相符的结果。