微生物转化井冈霉素制备假氨基糖类α-糖苷酶抑制剂的研究

摘要

α-糖苷酶抑制剂在糖尿病治疗中发挥着重要作用，井冈胺作为α-糖苷酶抑制剂以及合成降糖药物的中间体，有着重要的药用价值和广阔的市场前景。由于井冈胺的化学合成工艺复杂，步骤繁多，利用生物转化制备井冈胺已成为当下研究热点。本论文利用生物农药井冈霉素为原料，对利用微生物转化井冈霉素制备井冈胺进行了系统研究。
　　 本文通过碱水解阿卡波糖的方法制备井冈胺粗品，利用732阳离子交换树脂和DOWEX1×2阴离子交换树脂纯化井冈胺粗品以制备井冈胺对照品，其得率约为1％。对井冈胺的TLC及HPLC检测条件进行了优化，优选出井冈胺的TLC检测条件为:展开剂:正丙醇∶冰乙酸∶水=4∶1∶1;显色剂:1％茚三酮溶液。对井冈胺柱前衍生化反应条件的研究结果表明:随着温度和时间的增加，衍生化反应程度更为充分，最终优选出的衍生化反应条件为:反应体系为:1％对氟硝基苯和1.5％三乙胺的二甲基甲酰胺溶液;反应水浴温度100℃;反应时间60min。衍生化产物HPLC检测的优选条件为:色谱柱:Phenomenex Gemini C18色谱柱;流动相∶乙腈-水(15∶85);柱温:30℃;流速:1.0ml/min;检测波长:398nm。
　　 利用采自不同区域的20份土样，在井冈霉素作为唯一碳源的培养基中进行转化菌株筛选，从2号土样中分离出细菌59株，真菌23株。以底物井冈霉素消耗量和产物井冈胺生成量为指标，采用TLC对82种微生物进行初筛，得到2株具有转化井冈霉素生成井冈胺的细菌。再以井冈胺产量为指标进行HPLC复筛，最终得到一株具有较高转化能力的菌株，编号为V2。
　　 对菌株V2转化井冈霉素产井冈胺的培养基组成和摇瓶发酵条件进行了初步优化，结果优选培养基为:蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、氯化钠0.5％、磷酸氢二钾0.7％、磷酸二氢钾0.3％、无水磷酸镁0.01％。最佳转化条件为:底物井冈霉素浓度1％，培养液初始pH8.0，培养时间6d，装液量50/250ml，发酵温度34℃，接种量15％。在此转化条件下井冈霉素的消耗量≥99，产物井冈胺的相对转化率为6.29。
　　 利用形态学观察、生理生化实验以及分子生物学方法对菌株V2进行鉴定。通过形态学观察，V2为芽孢杆菌。V2菌株生理生化实验研究表明，该菌为革兰氏阴性菌，菌株具有还原硝酸盐，液化明胶的能力;菌体可发酵葡萄糖产酸，但不产气;不可利用柠檬酸盐;菌体产生淀粉酶，过氧化氢酶;甲基红反应为阴性，VP反应结果不确定。16srDNA测序及测序结果同源性比对表明菌株V2为芽孢杆菌属Bacillus。通过构建进化发育树分析，菌株V2为芽孢杆菌属Bacillus oleronius的可能性最高。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 糖尿病概述

1．2 糖尿病治疗药物的分类及其作用机理

1．2．1 胰岛素促泌剂

1．2．2 胰岛素增敏剂

1．2．3 α—葡萄糖苷酶抑制剂

1．2．4 胰岛素及胰岛素类似物

1．2．5 二肽基肽酶—Ⅳ(DPP-Ⅳ)抑制剂

1．2．6 其他口服降糖药

1．2 α-糖苷酶抑制剂的研究

1．2．1 α-糖苷酶抑制剂概述与分类

1．2．2 从植物中提取α-糖苷酶抑制剂

1．2．3 来源于食物的天然糖苷酶抑制剂

1．2．4 微生物来源的糖苷酶抑制剂

1．2．5 α-糖苷酶抑制剂的其他应用

1．3 井冈霉素与井冈胺类物质的研究

1．3．1 井冈霉素概述

1．3．2 井冈霉素的生产

1．3．3 井冈类物质的研究

1．3．4 井冈胺的生产

1．4 微生物转化井冈霉素生产井冈胺的研究

1．4．1 微生物降解井冈霉素的机理

1．4．2 可降解井冈霉素的微生物

1．5 井冈霉素及井冈胺衍生物的分析检测方法

1．5．1 井冈霉素的分析方法

1．5．2 井冈胺衍生物的分析检测方法

1．6 本课题研究意义及主要内容

1．6．1 本文的研究意义

1．6．2 本课题的主要研究内容

第二章 井冈胺对照品的制备及其分析方法的研究

2．1 引言

2．2 实验材料、试剂和仪器

2．2．1 实验材料和试剂

2．2．2 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 井冈胺标准品的制备

2．3．2 微生物转化法制备井冈胺供试品

2．3．3 井冈胺TLC检测方法的建立

2．3．4 井冈胺HPLC分析方法的建立

2．4 结果与分析

2．4．1 井冈胺标准品的制备

2．4．2 所制井冈胺标准品的鉴定

2．4．2 TLC展开剂的确定

2．4．3 微生物转化井冈霉素制备井冈胺

2．4．4 井冈胺衍生化反应条件的确定

2．4．5 HPLC条件的确定

2．5 讨论

2．6 小结

第三章 井冈胺转化菌株的筛选及其发酵工艺优化

引言

3．1 实验材料、试剂和仪器

3．1．1 实验材料、培养基及试剂

3．1．2 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 井冈胺转化菌株的筛选

3．2．2 微生物转化制备井冈胺的发酵工艺优化

3．3 结果与分析

3．3．1 井冈胺转化菌株的筛选

3．3．2 微生物转化制备井冈胺的发酵工艺优化

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 井冈胺转化菌株V2的分类鉴定

引言

4．1 实验材料、试剂和仪器

4．1．1 实验材料

4．1．2 试剂

4．1．3 实验仪器

4．3 实验方法

4．3．1 V2菌株的形态特征观察

4．3．2 菌株V2的生理生化特性研究

4．3．3 V2菌株的分子生物学鉴定

4．4．1 V2菌株的形态特征观察

4．4．2 V2菌株的生理生化特性

4．4．3 V2菌株的分子生物学鉴定

4．5 讨论

4．6 小结

结论及展望

参考文献

致谢

声明