云芝生物转化无机硒生产富硒云芝糖肽的研究

摘要

硒作为人体微量元素，在抗氧化、抗应激、提高免疫力和防治癌症等方面起着重要的作用，但无机硒的毒性大且利用率低。与无机硒相比，有机硒具有更高的吸收率、生物活性强、毒性低等特点。富硒云芝糖肽是云芝糖肽与硒形成的有机硒复合物，利用云芝生物转化作用将无机硒亚硒酸钠转化为有机硒，进而形成富硒云芝糖肽，以进一步增强云芝糖肽的抗肿瘤功效，降低放化疗毒副反应。
　　首先，采用石墨炉原子吸收光谱法检测富硒云芝糖肽中的硒含量，通过探究微波消解条件：消解试剂的种类和用量，微波消解温度和时间，以及原子吸收光谱法中的基体改进剂、灰化温度、原子化温度进行了优化，进行了精确性、准确度、线性、范围等方法学研究，建立了石墨炉原子吸收法测定富硒云芝糖肽中硒含量的方法：选用硝酸:过氧化氢（5:1）作为消解试剂，硝酸使用量为3ml，过氧化氢使用量为0.6ml，微波消解温度为180℃，酸解3小时；选用硝酸钯作为基体改进剂，灰化温度1200℃，原子化温度1900℃。
　　通过代料栽培云芝获得云芝子实体，分离云芝单孢子，进行PDA平板复壮培养获得云芝菌株；利用2％溶壁酶于32℃水浴振荡酶解云芝菌丝体3 h制备云芝原生质体，再通过0s、30s、60 s、90s、120 s和150s的紫外照射诱变和再生培养获得云芝突变株。通过分离获得150株突变菌株，在含有80μg/ml亚硒酸钠的PDA平板于26℃培养箱中进行初筛培养，根据菌株硒的耐受率，筛选出耐硒能力较强的三株诱变云芝菌株5.9-30-1、6.26-30-4、9.20-60-5；最后在26℃条件下，进行深层液体富硒发酵72h，通过复筛比较诱变菌株的菌丝体得率，云芝糖肽收率，硒含量，获得具有较强耐硒能力的富硒诱变云芝菌株5.9-30-1：菌株5.9-30-1硒耐受率为2.20%，菌丝体得率为11.45g/l，菌丝体硒含量为469mg/kg，云芝糖肽得率为1.26g/l，云芝糖肽硒含量为401.6mg/kg。
　　本文考察了富硒云芝糖肽的提取工艺，按照水提醇沉法提取富硒云芝糖肽，通过考察水料比、提取温度、提取时间优选得到了富硒云芝糖肽的提取工艺条件：提取时间4h，水料比30:1，提取温度95℃。实验探究验证了摇瓶富硒发酵的单因素条件，确定了接种量、装液量、亚硒酸钠浓度三个关键因素，利用Design-Expert.8软件进行了三因素三水平响应面实验对发酵液工艺中接种量、温度和转速进行条件优化实验的设计，得到富硒云芝糖肽的最佳生产工艺：接种量为11.18%，装液量为9.39%，亚硒酸钠添加量30μg/ml时，富硒云芝糖肽中硒含量259.3mg/kg。与优化预测值相比，其相对误差在10%左右。

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第一章 前言

1.1 立题背景

1.2 硒的研究进展

1.3 展望

第二章 富硒云芝糖肽中硒含量测定方法研究

2.1 引言

2.2 实验材料、试剂和仪器

2.3 实验方法

2.4 结果

2.5 讨论

2.6 小结

第三章 原生质体紫外诱变选育富硒云芝优良菌株

3.1 引言

3.2 实验材料、试剂和仪器

3.3 实验方法

3.4 结果

3.5 讨论

3.6 小结

第四章 富硒云芝糖肽生产工艺的研究

4.1 引言

4.2 实验材料、试剂与仪器

4.3 实验方法

4.4 结果

4.5 讨论

4.6 小结

第五章 总结和展望

5.1总结

5.2展望

参考文献

攻读学位期间的科研工作和成果

致谢

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