富硒碱溶性茶蛋白抗氧化肽的制备、分离纯化及结构研究

摘要

硒是动植物和微生物营养中重要的微量元素，其生物学作用主要由硒蛋白或硒多肽来体现。茶蛋白具有一定的抗氧化性，介于蛋白质和氨基酸之间的肽类，与其他生物分子相比，具有良好的生物活性和多样性，其安全性更高，抗氧化性更显著。将微量元素硒同茶蛋白多肽有效结合起来研究，开发富硒茶蛋白多肽将具有较高的应用价值。
　　本论文以富硒茶为原料，提取富硒碱溶性茶蛋白，用不同的酶进行酶解，以多种抗氧化为指标，制备出具有高抗氧化活性的含硒肽，并对其进行分离纯化、结构鉴定和功能分析。
　　主要研究结果如下:
　　(1)与非富硒茶相比，富硒茶中茶多酚含量有所降低，游离氨基酸含量有所升高，说明硒可以提高茶叶中游离氨基酸含量，降低茶多酚含量，从而减少涩味，提升鲜味，改善茶叶的口感。同时该样品中有机硒的含量大于80％，符合有机硒含量标准。
　　(2)以茶多酚与茶蛋白的质量比值为指标，通过单因素实验和响应面分析优化确定了富硒碱溶性茶蛋白提取工艺最优条件为:PVPP用量4.37 mg/mL，NaOH浓度0.14M，提取温度30℃，此时茶多酚与茶蛋白的质量比值为0.089。
　　(3)以清除自由基能力为指标，从四种蛋白酶（碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶）中确定了制备抗氧化肽的最适水解用酶为木瓜蛋白酶。通过单因素实验和响应面分析优化确定了最佳酶解条件为:pH值7.45，反应温度55℃，加酶量1900 U/g蛋白，反应时间3.4 h，此条件下酶解产物对羟自由基的抑制率为66.9％。
　　(4)富硒碱溶性茶蛋白酶解肽混合物经超滤分离得到三个组分TPepⅠ(＜1kDa)、TPepⅡ(1～10 kDa)和TPepⅢ(10～100 kDa)，其清除自由基能力大小顺序为:TPepⅠ＞TPepⅢ＞ TPepⅡ。硒含量大小顺序为: TPepⅢ＞TPepⅡ＞TPepⅠ。组分TPepⅠ经凝胶SephadexG-25洗脱得到两个组分TPepⅠ-1和TPepⅠ-2，其清除自由基能力大小顺序为:TPepⅠ-1＞TPepⅠ-2，组分TPepⅠ-1的硒含量高于组分TPepⅠ-2。组分TPepⅠ-1经红外分析，得出该组分多肽中含有N-H键、O-H键、C-H键、C=O键和C-N键，说明该组分可能是含有多羟基的短肽。组分TPepⅠ-1经氨基酸分析仪和UPLC-Q-TOF-MS分析，得到两条抗氧化多肽序列LPMFG(Leu-Pro-Met-Phe-Gly)和YPQSFIR(Tyr-Pro-Gln-Ser-Phe-Ile-Arg),其分子量分别为563.27 Da和909.47 Da。其抗氧化主要体现在:1）含有疏水性氨基酸（Leu、Pro、Met、Phe和Ile），可以与氧结合或抑制脂质中氢的释放来延缓脂质过氧化链式反应;2）含有Pro和Phe，能与金属离子螯合，可以终止因金属离子催化而产生的氧化还原反应;3）含有Leu和Tyr，可以提供质子，与自由基结合，终结氧化还原反应:4）含有Gly和Ser，能与水杨醛缩合产物可与铁离子形成2:1的复合物，可抑制与铁离子有关的羟自由基产生，并能抑制脂质过氧化。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 茶蛋白

1．1．1 茶蛋白概述

1．1．2 茶蛋白的提取研究进展

1．1．3 茶蛋白及多肽的活性研究进展

1．2 硒及硒蛋白的研究进展

1．2．1 硒的摄入、转运和代谢

1．2．2 硒蛋白的分布、结构和功能

1．2．3 硒蛋白与疾病之间的关系

1．3 抗氧化肽的研究进展

1．3．1 抗氧化肽的来源

1．3．2 抗氧化肽的制备

1．3．3 抗氧化肽的结构研究进展

1．4 本课题的研究目的和意义

1．5 本课题研究的主要内容

第二章 富硒碱溶性茶蛋白的制备

2．1 实验材料与仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 茶叶样品成分测定

2．2．2 富硒碱溶性茶蛋白提取流程

2．2．3 富硒碱溶性茶蛋白提取单因素实验

2．2．4 富硒碱溶性茶蛋白提取工艺优化实验

2．2．5 分析方法

2．3 结果与分析

2．3．1 富硒茶成分测定结果

2．3．2 富硒碱溶性茶蛋白提取单因素实验结果

2．3．3 富硒碱溶性茶蛋白提取工艺优化实验结果

2．4 本章小结

第三章 富硒碱溶性茶蛋白抗氧化肽的制备

3．1 实验材料与仪器

3．1．1 实验试剂

3．1．2 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 富硒碱溶性茶蛋白溶液的制备

3．2．2 富硒碱溶性茶蛋白酶解液的制备

3．2．3 蛋白酶的选择

3．2．4 富硒碱溶性茶蛋白酶解单因素实验

3．2．5 富硒碱溶性茶蛋白酶解优化实验

3．2．6 分析方法

3．3 结果与分析

3．3．1 蛋白酶的选择结果

3．3．2 富硒碱溶性茶蛋白酶解单因素实验结果

3．3．3 富硒碱溶性茶蛋白酶解优化实验结果

3．4 本章小结

第四章 抗氧化肽的分离纯化及结构鉴定

4．1 实验材料与仪器

4．1．1 实验试剂

4．1．2 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 富硒碱溶性茶蛋白抗氧化肽超滤分离

4．2．2 凝胶Sephadex G-25纯化富硒碱溶性茶蛋白抗氧化肽

4．2．3 富硒碱溶性茶蛋白抗氧化肽红外分析

4．2．4 富硒碱溶性茶蛋白抗氧化肽氨基酸组成分析

4．2．5 富硒碱溶性茶蛋白抗氧化肽UPLC-Q-TOF-MS分析

4．2．6 分析方法

4．3 结果与分析

4．3．1 富硒碱溶性茶蛋白抗氧化肽超滤分离及活性测定

4．3．2 组分TPepⅠ凝胶纯化及活性测定

4．3．3 组分TPepⅠ-1红外分析结果

4．3．4 组分TPepⅠ-1氨基酸组成测定结果

4．3．5 组分TPepⅠ-1的UPLC-Q-TOF-MS分析结果

4．4 本章小结

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

致谢

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