基于转录组测序的红盖鳞毛蕨类黄酮3’-羟化酶(F3’H)基因的克隆与表达分析

摘要

黄酮是一类广泛存在于植物体内的次生代谢产物，它具有抗氧化、抑菌消炎、抑制肿瘤细胞活性、抗HIV活性等功能，且毒性较小。相比于其他植物类群，蕨类植物中的黄酮具有含量高，种类多样的特点，但其黄酮的代谢途径仍不清楚，类黄酮3'-羟化酶(F3'H)属于细胞色素P450家族蛋白，是黄酮合成途径中重要的关键酶之一，主要催化柚皮素和二氢山柰酚，生成圣草酚和二氢槲皮素，而这两种产物是黄酮生物合成途径中重要的中间产物。研究蕨类植物F3'H基因，为阐明其代谢途径的分子机制提供基础资料，对揭示植物黄酮代谢的演化及调控机制具有一定的科学意义。
　　本研究以红盖鳞毛蕨为实验材料，利用转录组测序和PCR技术对F3'H基因进行克隆和表达分析，并对该序列在基因结构，蛋白结构和理化性质三方面做生物信息学分析。本研究的实验结果主要有以下几个方面:
　　1.通过Hi-seq2000平台测序，获得红盖鳞毛蕨总计8504366760nt转录组数据。对获得的短序列reads进行数据过滤、组装、拼接获得Unigene总共143604个，将这些Unigene注释到蛋白数据库中，可比对上的编码蛋白库(CDS)有69917个。根据注释结果分析获得F3'H可能性基因62条，从中选定7条作为F3'H候选基因。
　　2.利用转录组测序获得的序列信息，从红盖鳞毛蕨中成功克隆获得7条F3'H候选基因的完整ORF区序列，命名为DeF3'H-1、DeF3'H-2、DeF3'H-3、DeF3'H-4、DeF3'H-5、DeF3'H-6、DeF3' H-7，通过生物信息学分析表明，其基因ORF区长度分别为1533bp、1599bp、1539bp、1575bp、1455bp、1590bp、1491bp、分别编码510、532、512、524、484、529、496个氨基酸。
　　3.本实验成功构建构建DeF3'H-3基因的重组子pET32a-DeF3'H-3，并成功转入表达感受态BL21中，使用IPTG诱导获得融合蛋白，经过SDS-PAGE鉴定获得的蛋白大小约为65kDa，与预期的蛋白大小相一致，这为后续的酶活功能鉴定工作奠定了基础。
　　4、通过生物信息学分析对获得的DeF3'H-3基因的基因结构、蛋白理化性质方面进行预测。预测其分子式为C2605H4158N708O716S25，理论蛋白分子量为57653.48Da，等电点为8.05。氨基酸序列分析结果表明，DeF3'H-3的氨基酸序列包含有F3'H蛋白的保守区域“LPPGP”和血红素结合域“AGTDT”，与水稻(Oryza sativa)、猕猴桃（Actinidia chinensis）、野茶树（Camellia sinensis）相似性分别为46％、44％、42％，具有的相似性相对较低，DeF3'H-3基因在蕨类植物中的功能是否同种子植物中F3'H的相一致值得后续进一步实验验证。
　　综上，本研究以红盖鳞毛蕨为研究材料，对其进行转录组测序，为红盖鳞毛蕨分子生物学的研究提供了大量的数据。此外，对黄酮生物合成途径中的关键酶之一——类黄酮3'-羟化酶基因进行克隆与表达分析，为研究黄酮途径中的功能基因的分子机制做铺垫。此外，也为该基因起源和进化研究提供基础资料。

目录

摘要

第1章 前言

1．1 蕨类概述

1．1．1 蕨类植物的分布及分类地位

1．1．2 蕨类植物的主要应用价值

1．1．3 蕨类植物分子生物学研究进展

1．2 红盖鳞毛蕨

1．2．1 红盖鳞毛蕨的分类地位与分布

1．2．2 红盖鳞毛蕨的形态特征与生境

1．2．3 红盖鳞毛蕨的研究进展

1．3 黄酮类化合物

1．3．1 黄酮的结构和分类

1．3．2 黄酮类化合物的功能与应用

1．3．3 黄酮类化合物的生物合成途径

1．3．4 黄酮的研究进展

1．4 类黄酮3’-羟化酶

1．4．1 类黄酮3’-羟化酶基因结构

1．4．2 类黄酮3’-羟化酶的表达调控

1．4．3 类黄酮3’-羟化酶的转录调控

1．4．4 类黄酮3’-羟化酶的研究进展

1．5 转录组测序简介

1．6 本研究的目的和意义

第2章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 实验采用植物材料

2．1．2 引物合成及基因测序

2．1．3 质粒

2．1．4 菌株

2．1．5 酶

2．1．6 实验采用的分子和生化试剂

2．1．7 仪器及设备

2．2 实验方法

2．2．1 红盖鳞毛蕨的转录组测序

2．2．2 红盖鳞毛蕨F3’H基因家族的克隆

2．2．3 红盖鳞毛蕨F3’H基因的表达

2．2．4 红盖鳞毛蕨F3’H基因家族的生物信息学分析

第3章 结果与讨论

3．1 红盖鳞毛蕨转录组测序结果

3．1．1 转录组数据项目结果总结

3．1．2 转录组数据产量统计

3．1．3 组装质量统计

3．1．4 Unigene功能注释及COG分类

3．1．5 Unigene的GO分类

3．1．6 Unigene的代谢通路分析

3．1．7 预测编码蛋白框

3．2 红盖鳞毛蕨F3’H基因家族全长的克隆

3．2．1 红盖鳞毛蕨总RNA的提取

3．2．2 DeF3'H基因家族序列ORF区的克隆

3．2．3 DeF3'H-3的表达载体的构建

3．2．4 DeF3'H-3的诱导表达

3．3 DeF3'H-3的生物信息学分析

3．3．1 DeF3'H蛋白的理化性质预测

3．3．2 DeF3'H-3蛋白亲／疏水性的预测

3．3．3 DeF3'H-3蛋白的二级结构预测

3．4 讨论

3．4．1基于Hi-seq 2000测序的DeF3'H-3基因的分析

3．4．2 DeF3’H氨基酸序列的探讨

3．4．3 DeF3’H基因进化的探讨

第4章 总结与展望

参考文献

致谢

攻读学位期间的研究成果

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