荧光假单胞菌M18及其rsmA-突变株的电镜观察和双向电泳研究

摘要

荧光假单胞菌是一类重要的生防菌，在农业生物防治中有着广泛的应用。本研究所用M18菌株是国际上首次发现的能够同时产生藤黄绿菌素（Plt）和吩嗪-1-羧酸（PCA）两种抗生素的假单胞菌株，对农作物病害具有广泛的抑制作用。次生代谢阻遏蛋白（rsm）A能够在转录后水平上，对细菌的次生代谢和行为起着全局性调控作用。rsmA基因被敲除后的rsmA－突变株在King’ B固体培养基、28℃培养36hr的条件下，在菌落的大小和形态、生长曲线、Plt和PCA的产量等方面体现出与野生型菌株十分不同的特征；现已知rsmA在大肠杆菌和肠沙门氏杆菌中的同源物CsrA能够影响细胞大小和细胞表面特征，这提示野生型和突变型可能在细胞大小、形态结构、蛋白表达等方面同样存在某些差异。 本研究的目的在于：1.了解rsmA基因对M18细胞大小、表面特征、内部结构的影响。2.了解rsmA基因对细胞内蛋白表达的影响，并试图寻找出与rsmA关系密切的一些蛋白。 本实验所用菌株均为King’ B固体培养基、28℃倒置培养36hr。采用扫描电镜和透射电镜（负染、超薄切片）对野生型和突变型菌体进行了观察。根据透射电镜（负染）的结果，野生型和突变型分别随机测量30个菌体的大小，并运用SPSS 统计分析软件进行两独立样本均值的t检验，以确定两菌株的菌体大小是否存在明显差异。本实验采用Bio-Rad公司pH3-10/7cm、pH5-8/7cm的IPG胶条和PROTEAN 等电聚焦仪、Mini-PROTEAN III型垂直电泳槽进行双向电泳。研究了不同的水化上样液（ReadyPrep 2-D水化/上样缓冲液、ReadyPrep蛋白顺序抽提试剂III）、不同的SDS-PAGE凝胶浓度（12％、15％）、不同的染色方法（考马斯亮蓝R250、Bio-Safe考马斯、荧光染色）对电泳结果的影响。根据优化的方法分别构建了野生型和突变型pH3-10和pH5-8范围的双向电泳图谱，并运用ImageMaster图像分析软件进行了点检测、凝胶匹配、差异点显示等初步分析。 扫描电镜和透射电镜的结果均显示，野生型和突变型的细胞表面特征和内部结构存在十分明显的差异。从扫描电镜的结果看，突变型细胞表面有许多白色小点，使细胞表面显得十分粗糙；与此相反，野生型细胞表面则比较光滑。从负染和超薄切片的结果看，突变型的细胞边缘存在很多电子密度很低、可能是质周体的结构，而这一结构在野生型细胞中几乎观察不到。统计学分析的结果显示野生型菌体大小为1.71×0.56?m，而突变型为1.35×0.55?m，野生型菌体长度明显大于突变型。双向电泳和图像分析的结果显示，野生型和突变型的蛋白表达存在一系列明显的差异。在pH 3-10范围的电泳图谱上可见一十分明显的蛋白点(pI8.17879,MW10767)为野生型所特有。在pH5-8的电泳图谱中pH5-7范围的分辨率大大提高，经图像分析，野生型和突变型分别检出399和374个蛋白点，匹配率为85.97％，分别有67和42个蛋白点未能匹配，视为差异点，其中pI6.01632，MW21923的蛋白点为突变型所特有。 在上述结果的基础上可得出以下结论：1.在 King’ B固体培养基、28℃倒置培养36hr的条件下（下同），rsmA基因对荧光假单胞菌M18的菌体大小有显著影响，这一基因的缺失使菌体长度变小。2. rsmA基因影响荧光假单胞菌M18的细胞表面特征和内部结构，rsmA基因的敲除使细胞表面由光滑变为粗糙。3. rsmA基因与荧光假单胞菌M18内一系列蛋白的表达相关，rsmA基因的缺失使pI6.01632，MW21923的蛋白点出现而pI8.17879，MW10767的蛋白点消失。