TrkB介导的失巢凋亡抑制与卵巢癌的转移和耐药

摘要

失巢凋亡(anoikis)是由于细胞与细胞外基质和其它细胞失去接触而诱导的一种程序化死亡形式，发生在肿瘤细胞转移的起始阶段，是抑制肿瘤细胞转移的人体重要防御机制之一。PI3K/AKT信号通路参与多种肿瘤的发生发展，在肿瘤细胞中PI3K/AKT信号通路通常异常激活。该信号通路激活后通过调控凋亡的线粒体途径，介导凋亡/失巢凋亡抑制，使肿瘤细胞逃避凋亡从而赋予肿瘤细胞化疗耐药和高转移。酪氨酸激酶受体B(tyrosinekinasereceptor，TrkB)是原癌基因Trk-编码神经营养酪氨酸激酶受体(neurotrophictyrosinekinasereceptor，NTKR)的家族成员之一，其配体是脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF)。TrkB可通过激活PI3K/AKT信号通路抑制上皮细胞失巢凋亡和诱导其转移，在神经母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌和骨髓瘤等高侵袭肿瘤中过度表达。 研究表明：转移癌细胞的化疗耐受性增强，故高转移和化疗耐药有可能受控于相同的分子调控机制，失巢凋亡在这一过程中可能发挥重要的作用，抗失巢凋亡抑制可能是肿瘤治疗的最新策略。高转移和化疗耐药是卵巢癌的主要特征，但是迄今为止，TrkB在卵巢癌的失巢凋亡抑制及其与卵巢癌高转移和化疗耐药的关系尚未见报道。在本研究中，以卵巢癌的失巢凋亡抑制为切入点，通过细胞贴壁培养模拟癌细胞在原发灶的生存状态；通过立体培养筛选出获得失巢凋亡抑制表型的癌细胞以模拟卵巢癌病人体内脱离原发灶发生转移，并存活于腹水中的多细胞团簇的生存状态；将多细胞团簇经胰酶消化后再次贴壁培养，模拟体内发生失巢凋亡抑制并生成转移灶的癌细胞的生存状态；研究TrkB是否介导卵巢癌细胞的失巢凋亡抑制及其信号调控机制。本文分以下三个步骤进行研究： 1.检测TrkB在卵巢上皮性癌中的表达及其意义。研究结果提示：卵巢上皮性癌中存在TrkB及高亲和力配体BDNF的过度表达；卵巢癌细胞获得失巢凋亡抑制时，全长TrkB在其前体蛋白高表达的基础上表达明显增加。 2.分析卵巢癌中TrkB过度表达与PI3K/AKT信号通路激活及其失巢凋亡抑制的关系。研究结果提示：卵巢癌中TrkB过度表达能激活PI3K/AKT信号通路并诱导卵巢癌细胞的失巢凋亡抑制。 3.探讨TrkB诱导卵巢癌细胞失巢凋亡抑制的信号调控机制及其与卵巢癌高转移和化疗耐药的关系。研究结果提示：TrkB过度表达激活PI3K/AKT信号通路，后者通过对Bcl-2家族蛋白表达及功能调控诱导卵巢癌的失巢凋亡抑制，使其获得高转移和化疗耐药的特性。 本研究结论：在卵巢癌细胞中，酪氨酸激酶受体B在卵巢癌细胞中过度表达，并能激活PI3K/AKT信号通路，继而该信号通路通过调控Bcl-2家族蛋白的表达及功能诱导卵巢癌细胞失巢凋亡抑制，最终赋予卵巢癌细胞高转移和化疗耐药。 第一部分：酪氨酸激酶受体B在卵巢上皮性癌中的表达及其意义 目的：检测失巢凋亡抑制因子酪氨酸激酶受体B(TrkB)在卵巢上皮性癌中的表达及其意义。 方法：RT-PCR和real-timePCR、免疫组化、westernblot方法检测卵巢上皮性癌组织(包括相应的大网膜转移灶和腹水中的癌细胞团簇)中TrkB及其配体-脑源性神经营养因子(BDNF)的表达；卵巢癌细胞系OVCAR-3细胞贴壁培养、立体培养以及细胞立体培养得到的多细胞团簇经胰酶消化成单细胞后再次贴壁培养细胞TrkB的表达差异。 结果：RT-PCR结果显示，TrkB及BDNFmRNA高表达于卵巢上皮性癌组织中，尤其高表达于大网膜转移灶和腹水中的癌细胞团簇中。大网膜转移灶和腹水中的癌细胞团簇中的TrkB及BDNFmRNA相对表达量分别为31.43±1.41％和97.56±1.50％，28.20±0.72％和73.51±0.51％，与相应的原发灶(18.06±1.09％和39.66±0.59％)比较差异有统计学意义(P＜0.001)；TrkB及BDNFmRNA在卵巢癌与卵巢交界性肿瘤中的相对表达量分别为11.71±2.12％和21.17±0.76％(卵巢癌)，4.59±0.40％和12.60±0.88％(卵巢交界性肿瘤)，两者在卵巢癌组织中表达明显增加(P＜0.001)。与贴壁培养细胞比较，TrkBmRNA高表达于OVCAR-3多细胞团簇中，两组数值分别23.51±0.51％，35.29±0.67％，差异有统计学意义(P＜0.001)；BDNFmRNA的表达则正相反，两组数值分别41.42±0.58％，32.23±0.70％，差异有统计学意义(P＜0.001)。并进一步行real-timePCR检测，结果与RT-RCR的相一致。免疫组化结果显示，全长TrkB的前体蛋白(未发生糖基化的受体形式，表达于细胞浆)广泛地高表达于卵巢上皮性癌组织中；全长TrkB(发生糖基化的完整受体形式，145000，表达于细胞膜)高表达于腹水中的癌细胞团簇和低分化卵巢癌组织中。Westernblot结果显示，TrkB的前体蛋白(大约115000)，广泛地高表达于上述三种不同培养方式的OVCAR-3细胞中；与贴壁培养细胞比较，OVCAR-3细胞立体培养全长TrkB明显高表达(P＜0.001)。 结论：卵巢上皮性癌中存在TrkB及B=DNF的过度表达，并且全长TrkB和BDNF在转移癌、低分化癌中表达增加。这提示，卵巢上皮性癌肿可能存在TrkB/BDNFI的自分泌环路，TrkB可能是介导卵巢癌细胞失巢凋亡抑制的因子。 第二部分：酪氨酸激酶受体B过度表达与卵巢癌细胞PI3K/AKT信号通路激活及其失巢凋亡抑制的关系 目的：分析酪氨酸激酶受体B过度表达与卵巢癌细胞PI3K/AKT信号通路激活及其失巢凋亡抑制的关系 方法：Westernblot、siRNA干扰技术检测卵巢癌细胞系OVCAR-3细胞不同培养方式以及TrkB干扰前后PI3K/AKT信号通路活性的差异以及TrkB干扰后细胞失巢凋亡的情况。 结果：OVCAR-3多细胞团簇(细胞立体培养)全长TrkB表达最多，PI3K/AKT信号通路活性最强，其次是OVCAR-3细胞立体培养得到的多细胞团簇经消化成单细胞后再贴壁培养细胞，OVCAR-3贴壁培养细胞全长TrkB的表达最少，PI3K/AKT信号通路活性也最弱(P＜0.001)，TrkB干扰后OVCAR-3细胞PI3K/AKT信号通路活性被抑制(P＜0.001)，OVCAR-3细胞失巢凋亡增加(P＜0.001)。 结论：TrkB过度表达能激活PI3K/AKT信号通路并诱导卵巢癌细胞的失巢凋亡抑制。 第三部分：酪氨酸激酶受体B诱导的卵巢癌细胞失巢凋亡抑制的信号调控机制及其与卵巢癌高转移和化疗耐药的关系 目的：探讨酪氨酸激酶受体B介导的卵巢癌细胞失巢凋亡抑制的信号调控机制。 方法：Westernblot、siRNA干扰技术、MTT和FACS检测OVCAR-3多细胞团簇、贴壁培养细胞以及贴壁培养细胞TrkB干扰联合化疗药物作用后Bcl-Xl、Bad的表达差异；OVCAR-3多细胞团簇经胰酶消化后再贴壁培养细胞与贴壁培养细胞经单用化疗药物以及药物联合LY294002处理后对化疗药物敏感性差异；体内、体外细胞侵袭实验检测通过RNAi技术沉默TrkB后OVCAR-3细胞侵袭及转移能力的改变。 结果：OVCAR-3多细胞团簇Bcl-Xl、Bad的表达明显高于贴壁培养细胞(P＜0.001)，TrkB干扰联合化疗药物(紫杉醇、顺铂)作用后OVCAR-3贴壁培养细胞的Bcl-Xl、Bad的表达较单用化疗药物明显减少(P＜0.001)。当紫杉醇作用后，OVCAR-3多细胞团簇Bcl-Xl、Bad的表达高于贴壁培养细胞；当顺铂作用后得出与上述相反的结果(P＜0.001)。与普通贴壁细胞相比较，OVCAR-3多细胞团簇再次贴壁培养细胞显示出增强的化疗(紫杉醇、顺铂)耐受性(P＜0.001)，LY294002联合紫杉醇在降低了OVCAR-3卵巢癌细胞的生存率(p＜0.01)的同时增加了细胞的凋亡(P＜0.001)。体体外细胞侵袭实验表明OVCAR-3多细胞团簇的侵袭转移能力较普通贴壁培养细胞明显增强(P＜0.001)；TrkB沉默后OVCAR-3细胞的侵袭及转移能力受到抑制(P＜0.001)。体内实验结果显示OVCAR-3团簇细胞生成广泛的转移瘤，TrkB沉默后OVCAR-3细胞生成的肿瘤局限于肠系膜内，体积微小(P＜0.03). 结论：TrkB是诱导卵巢癌细胞失巢凋亡抑制的因子，通过PI3K/AKI信号通路对：Bcl-2家族蛋白的表达及功能调控诱导卵巢癌细胞的失巢凋亡抑制，赋予卵巢癌细胞高转移和化疗耐药。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分酪氨酸激酶受体B在卵巢上皮性癌中的表达及其意义

引言

材料和方法

结果

附图

讨论

第二部分酪氨酸激酶受体B过度表达与卵巢癌P13K/AKT信号通路激活及其失巢凋亡抑制的关系

引言

材料与方法

结果

附图

讨论

第三部分酪氨酸激酶受体B诱导卵巢癌细胞失巢凋亡抑制的信号调控机制及其与卵巢癌高转移和化疗耐药的关系

引言

材料和方法

结果

附图

讨论

第四部分结论

酪氨酸激酶受体B介导的信号转导通路与肿瘤的失巢凋亡抑制

参考文献

博士期间发表的和待发表的论文

致谢