规模化挖掘小鼠肝脏再生过程中的重要蛋白相互作用及其验证

摘要

肝脏是人以及动物体内最为重要的内脏器官，具有分解糖、贮存糖原；参与蛋白质、脂肪、维生素、激素的代谢；解毒；分泌胆汁；吞噬、防御机能；制造凝血因子；调节血容量及水电解质平衡；产生热量等功能。在胚胎时期肝脏还有造血功能，是体内再生能力最强的器官。肝脏由肝实质细胞和非实质细胞构成，人和动物肝脏都具有极强的调节自身生长发育的能力。通常情况下，肝脏在遭受重大创伤或中毒时具有较强的再生能力，可以通过DNA合成与有丝分裂重建与机体大小相应的肝脏体积，但肝脏如果长期处于有毒物质或炎症等损伤因素下则可能导致肝纤维化、肝硬化等疾病的产生。在这两类疾病中，肝脏的再生功能都在一定程度上得到了抑制。因此，肝脏再生机制的研究对于肝脏再生能力丧失或受损的病人的救治以及肝脏功能的恢复都具有十分重要的意义。在这个背景之下为了更好的认识人类肝脏，人类蛋白质组组织(Human Proteome Organization，HUPO)启动了人类肝脏蛋白组计划(Human Liver Proteome Project，HLPP)项目，这是由我国贺福初院士领衔的项目，也是我国在生命科学领域第一次主持的重大国际协作计划。 人类肝脏蛋白质计划中一个重要任务是认识肝脏再生过程中重要蛋白相互作用。蛋白质相互作用是一切生命活动的基础，揭示相互作用规律是认识生命奥秘的必经之路。蛋白质相互作用不仅仅是正常生理过程中如DNA复制、转录、翻译、信号传导和细胞调控的基础，也是在病理过程中起着重要作用。 酵母双杂交技术是目前应用于大规模研究蛋白质相互作用最成功的技术平台，是现在研究活细胞体内的蛋白质相互作用的主要技术手段之一，同时可以用于研究蛋白质连锁群和蛋白质功能网络系统。通过酵母双杂交可以检测一对功能已知的蛋白质之间的相互作用、可以研究一对蛋白间发生相互作用的结构域、用已知功能蛋白基因筛选双杂交的cDNA文库来研究蛋白质之间相互作用的传递途径等。 生物信息学是指应用信息科学的理论、方法和技术，研究生物体系和生物过程中信息的存储、信息的内涵和传递，研究生物体细胞、组织、器官的生理、病理和药理过程中的各种生物信息。生物信息学可以研究蛋白质结构和功能，还可以研究蛋白质进化问题和蛋白质相互作用的预测等。 本论文的研究基于目前研究蛋白质相互作用的成果之上，主要有以下两个方面的工作： 1 小鼠肝脏再生过程中重要蛋白相互作用的规模化挖掘及其网络的生物信息学分析：本实验室采用CCl4腹腔注射的方法建立了CCl4注射小鼠肝损伤模型，并在损伤后的0.5、1.5、3、4.5、7天时分别采集小鼠肝脏样本，用于制作Affymetrix公司的gene chip? Mouse 430 2.0芯片。根据芯片检测所得数据显示在肝脏修复的七天周期内有若干基因变化，分析这些基因，从现有的数据库中手工获得与这些基因有相互作用的基因，首次构建了在肝脏再生过程中重要蛋白相互作用的网络图；然后采用生物信息学的手段对该蛋白质相互作用网络图进行分析，我们以实验数据、可信度评价结果及大量的文献调研为依据，分别从发现潜在的信号通路间的交联、揭示重要功能蛋白的作用机制、揭示新蛋白的重要功能、揭示已知蛋白的其他重要功能、发现重要蛋白复合物角度出发，对得到的相互作用数据进行了深入的挖掘，并以部分相互作用为例进行了详细分析，为进一步揭示这些相互作用的生物学功能，尤其在肝脏再生中的功能研究提供了重要线索。 2 小鼠肝脏再生过程中部分蛋白质相互作用的酵母双杂交实验验证： 从蛋白质相互作用的网络中挑选5个重要基因进行克隆，在获得这些基因的同时也获得了这些基因对应的蛋白质。所选择的基因是在肝脏再生过程研究表明可能起到某些重要作用或者有可能起到重要作用，对这些基因进行生物信息学分析，主要是结构域的分析和蛋白质表面接触活性的分析；随后采用了酵母双杂交系统对这些蛋白质是否具有相互作用进行实验，对所产生结果进行分析，并且进行了一些生理功能的探索。 综上所述，本文针对肝脏再生过程中重要蛋白相互作用进行了分析，有效利用了肝脏再生过程中基因芯片数据，充分利用生物信息学方法和手段进行了肝脏再生过程中重要蛋白质相互作用网络的构建；随后用酵母双杂交方法验证了部分蛋白质相互作用。本课题第一次较完整的构建了肝脏再生过程中重要蛋白相互作用网络，为今后从重要蛋白相互作用入手研究肝脏再生奠定基础并且指明方向。