转紫杉二烯合成酶基因青蒿中紫杉烷类物质的分析

摘要

紫杉醇是一种被FDA批准用于治疗多种癌症的高效、广谱的抗癌药物。目前市场上所用的紫杉醇大多是从原材料红豆杉中直接提取或者提取紫杉醇合成途径中含量较多的前体物质，然后通过半合成而得来；由于红豆杉生长缓慢，加上红豆杉中相关的物质含量极低，现有技术条件难以满足市场需求，致使其药价昂贵，急需寻找新的解决途径。生物技术的不断发展，为解决紫杉醇等资源短缺问题提供了全新思路。目前，紫杉醇生物合成途径中的一些关键酶基因已经被成功克隆，通过建立红豆杉遗传转化体系，采用转基因方法提高这些关键酶基因表达，有可能改善紫杉醇资源问题。本研究对转紫杉二烯合成酶基因青蒿中紫杉烷类物质进行了分析。研究结果如下： ⑴采用农杆菌介导的转基因方法转化青蒿叶片，经潮霉素筛选，PCR 检测以及RT-PCR 分析得到了30 株基因在转录水平上表达了的青蒿植株。 ⑵比较了转基因青蒿植株与野生型青蒿植株的生长情况，从株高、分枝数、整株干重等农艺性状来看，该基因对亲代青蒿的生长并没有显著影响。从种子千粒重来看，转入该基因的青蒿植株有的种子变小，但对发芽率并没有多大影响，子代青蒿长势很好。PCR 检测了F1代青蒿中该基因的遗传，表明该基因已经稳定地遗传到了子代。 ⑶用GC-MS 检测了转基因青蒿中的紫杉二烯合成情况，得到了成功合成紫杉二烯的植株；以十九烷为内标，测得的转基因青蒿中紫杉二烯含量为4.4 ～129.7 mg/kg 干重。比较了不同时期的青蒿中紫杉二烯的含量，发现生长后期紫杉二烯含量有所提高。比较了青蒿不同部位的紫杉二烯含量，发现青蒿茎杆中的紫杉二烯含量高于叶片。 ⑷用HPLC-ELSD 测定了不同生长时期转基因青蒿以及野生型青蒿中青蒿素的含量，发现生长旺盛期产紫杉二烯的青蒿中的青蒿素的含量明显低于对照野生型青蒿植株。而后期（现蕾至枯萎期）青蒿素的含量在两者之间差别不大。 ⑸采用文献报道的紫杉二烯衍生物的质谱特征离子为选择离子，对所得的GC-MS数据进行了分析，在转基因青蒿植株中找到了5个差异峰，这5个差异峰在未转基因青蒿中均没有，但在红豆杉中对应都有，初步认为这5个峰是青蒿利用自身的细胞色素P450系列酶以紫杉二烯为底物合成的5个紫杉二烯衍生物，但具体结构还需采用其他检测技术进行进一步确认。