紫杉二烯合成酶及肿瘤血管生成抑制因子基因克隆与转基因研究

摘要

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的第二大杀手，寻找对肿瘤细胞具有高杀伤力而对正常细胞毒副作用小的新型抗肿瘤药物，具有非常重要的现实意义。本研究的目的旨在利用赤霉菌中存在的二萜类化合物赤霉素的代谢途径构建能够表达生产紫杉醇前体的重组赤霉菌，为20世纪人类发现的最重要的新型抗癌药物二萜类化合物紫杉醇开辟新的药源途径，为缓解药源短缺对紫杉醇应用范围进一步扩大造成的严重限制提供理论和技术依据；另一方面，为新一代抗肿瘤活性分子肿瘤血管生成抑制因子Arresten寻找安全、有效、廉价、易于推广应用的蛋白表达生产系统。 Ⅰ采用RT-PCR方法从红豆杉胚性愈伤组织细胞系E3B中克隆紫杉二烯合成酶基因全长cDNA。将可以在大肠杆菌BL21s中表达、序列正确的紫杉二烯合成酶基因全长cDNA引入表达载体pAN52-1Not的起始密码子ATG下游，并将选择标记潮霉素B抗性表达框引入pAN52-1Not完整转录单位的侧翼区域，获得紫杉二烯合成酶基因cDNA表达载体pANts-hyg。 Ⅱ采用PCR扩增法从赤霉菌基因组中克隆了赤霉素生物合成途径中第一个特异性关键酶——内根-贝壳杉烯合成酶基因cps的部分序列作为同源片断，以平端连接的方式引入丝状真菌表达载体pCSN44的HindⅢ位点，获得旨在中断赤霉素生物合成途径的cps基因打靶载体pCSNcps。 Ⅲ通过单因素实验建立了本实验用赤霉菌菌株原生质体制备方法。研究结果表明，以10ml含15％粗制崩溃酶的酶解体系于37℃酶解4h，6个实验用赤霉菌受试菌株的原生质体产量都可以达到106/mL，能够满足遗传转化操作的需要，而使用溶壁酶制备实验用赤霉菌菌株原生质体的产量不足103/mL。 Ⅳ建立了适用于赤霉菌菌株CBS195.34的原生质体/PEG法转化体系，通过原生质体/PEG转化法获得少量赤霉菌转化子。经过PCR检测及Southernblot杂交检测，证实本研究采用原生质体/PEG法以pANts-hyg转化获得一株基因组整合有紫杉二烯合成酶基因cDNA的赤霉菌转化子和4株pCSNcps转化、潮霉素B抗性水平高于亲本菌株的赤霉菌转化子。整合有外源基因的赤霉菌转化子的生长形态和生长能力与亲本菌株相比存在显著差异。而且，随着传代次数的增加，生长能力明显下降；用cps基因打靶载体pCSNcps转化赤霉菌的研究结果表明，简单的插入型打靶载体，即使携带足够长的同源序列，也不利于通过同源重组方式破坏靶基因cps而致使赤霉素合成中断的赤霉菌转化子的获得。 Ⅴ考查了电击转化和基因枪转化法对于实现赤霉菌遗传转化的有效性。研究结果初步表明，不同的赤霉菌菌株，其转化性能差异很大；电击转化法对提高赤霉菌原生质体转化效率没有明显效果；采用基因枪法转化赤霉菌菌丝断片也未获得比原生质体/PEG法更好的结果。 Ⅵ采用一步法RT-PCR从人胎盘组织中扩增出读码框架大小为690bp的肿瘤血管生成抑制因子ArrestencDNA。经亚克隆引入植物双元表达载pCAMBIA1301的NcoⅠ和BstEⅡ位点之间，获得目的基因植物表达载体pCAMBIAarr并通过冻融法将pCAMBIAarr转入根癌农杆菌LBA4404，获得携带目的基因的重组根癌农杆菌LBA4404(pCAMBIAarr)。 Ⅶ采用叶盘法以重组根癌农杆菌LBA4404(pCAMBIAarr)转化烟草秦烟95，经过潮霉素B筛选、PCR及Southenblot杂交检测，获得2个转基因烟草再生株，进一步的RT-PCR检测结果表明，目的基因在转基因烟草中存在转录水平上的表达。该结果同时也验证了选择标记的有效性和表达载体在宿主植物中的可用性，为进一步目的产物分离、生物活性及其他转基因作物的获得奠定了较好的实验基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

西北大学学位论文知识产权声明书及西北大学学位论文独创性声明

第一部分紫杉二烯合成酶基因克隆及其转化赤霉菌的研究

1文献综述

2材料和方法

3结果与分析

3.1紫杉二烯合成酶基因cDNA克隆

3.2 ts-cDNA丝状真菌表达载体构建

3.3 cps基因片断克隆及cps基因打靶载体构建

3.4赤霉菌原生质体制备

3.5赤霉菌转化

3.6赤霉菌转化子的鉴定

4讨论

5结论

6本研究创新点

7本研究有待进一步开展的工作

第二部分肿瘤血管生成抑制因子Arresten基因克隆及其对烟草的转化

1抗肿瘤药物的研究现状

2材料和方法

3结果与分析

4讨论

5结论

6本研究创新点

7本研究有待进一步开展的工作

参考文献

攻读博士学位期间研究成果和奖励

致谢