食源性致病菌多重PCR和基因芯片检测方法的建立

摘要

食源性致病菌是危害食品安全和人类健康的主要因素。常见的食源性致病菌主要包括金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲杆菌。本研究利用基因组比对方法挖掘单核细胞增生李斯特菌、阪崎肠杆菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7基因组中的特异性序列，建立了相关检测靶点库，设计和筛选特异性引物。同时整合其它已挖掘和报道的检测靶点和引物，利用筛选和整合的引物建立多重PCR体系和基因芯片方法，检测上述八种食源性致病菌。主要研究内容如下： ⑴多重PCR检测体系。利用引物nuc-j，Vp2，prs，C20，SG，ial，hly-A和hipO1，建立了八种食源性致病菌多重PCR检测体系，经优化后确定退火温度Tm值和Mg2+浓度分别为56oC和1.5 mmol/l，多重基因组DNA检测灵敏度可达到10 pg。 ⑵基于单碱基延伸标签反应的玻片芯片方法。通过多重PCR和玻片芯片技术联用，设计SBE-tags引物进行荧光标记反应，建立八种食源性致病菌的玻片芯片检测方法。该芯片方法的多重基因组DNA检测灵敏度和细菌纯培养物检测灵敏度分别为0.1 pg和5.0×102 cfu/ml，分离菌株检测结果与国标方法的符合率达到100％。 ⑶管式流动芯片检测方法。应用管式流动芯片系统检测八种食源性致病菌，检测高效特异，细菌纯培养物检测灵敏度可达到6.2×102 cfu/ml。相比较基于单碱基延伸标签反应的玻片芯片方法，管式流动芯片检测时间短1.5h，自动化程度高。