双特异性磷酸酶12及二硫键形成蛋白A类似蛋白与2型糖尿病的关联研究

摘要

研究目的： 研究双特异性磷酸酶12和二硫键形成蛋白A类似蛋白基因单核苷酸多态性与糖尿病的关系，初步探讨二硫键形成蛋白A类似蛋白在糖尿病发病机制中的作用。 (1)葡萄糖激酶是肝脏糖脂代谢的关键酶。葡萄糖激酶相关双特异性磷酸酶12(DUSP12)是近年来发现的一种表达于肝脏，能够与葡萄糖激酶特异性结合并且催化其磷酸化的磷酸酶。编码DUSP12的基因位于染色体1q21-23区域内，有研究表明该区域有与2型糖尿病密切相关的遗传关联位点。因此，DUSP12及其基因单核苷酸多态性是否可能与肝胰岛素敏感性及糖尿病的发生发展有关?本研究旨在探讨DUSP12基因多态性与中国人2型糖尿病的关系。 (2)二硫键形成蛋白A(DsbA)类似蛋白(DsbA-L)与DsbA具有高度相似的蛋白质一级和高级结构，后者是一种具有催化分泌蛋白质二硫键形成功能的强氧化酶。因此，DsbA-L很可能也具有催化二硫键形成的功能，并且已有研究发现DsbA-L可以增加高分子量脂联素的分泌。成熟胰岛素有3个二硫键，与正常胰岛素功能密切相关。这提示DsbA-L与胰岛素的形成可能有关。本研究首先探讨了DsbA-L基因与胰岛素生物合成及分泌以及与2型糖尿病的关系。其次，本研究还在细胞水平上对DsbA-L蛋白的功能进行初步研究。 研究对象与方法： (1)社区流行病学调查人群及医院门诊人群中选取577例上海地区中国人，其中糖耐量正常者359名，新诊断2型糖尿病患者218例；检测目标人群的身高、体重等人体测量学指标，受试者均进行口服糖耐量试验(OGTT)，检测糖脂代谢及胰岛素水平等血浆或者血清参数，用MRI检测受试者腹部皮下脂肪面积及腹内脂肪面积，用生物电阻抗法检测受试者体脂含量；用聚合酶链反应-限制性内切酶(PCR-RFLP)方法检测DUSP12基因-6735T/C变异。 (2)随机选取589名正常糖耐量者及556名2型糖尿病患者，并且进一步按照BMI将两组均分成正常体重亚组(BMI<24 kg/m2)和超重/肥胖亚组(BMI≥24 kg/m2)；对受试者进行人体测量学检测及OGTT检查，检测血浆或者血清中的糖脂代谢相关指标，检查受试者腹部皮下及腹内脂肪面积；测序检测OsbA-L基因中8个外显子及侧翼内含子区遗传变异位点；用PCR-RFLP法检测OsbA-L基因SNP-1308G/T(rs1917760)变异位点。 通过Western Blot方法检测MIN-6细胞中的DsbA-L经不同糖浓度培养后的蛋白质表达变化情况；在MIN-6细胞中过表达DsbA-L蛋白，观察葡萄糖刺激的胰岛素分泌水平。 研究结果： (1)对DUSP12基因-6735T/C多态性与2型糖尿病的关联分析发现： 1.糖尿病组与正常糖耐量组间DUSP12基因-6735T/C多态位点各基因频率分布差异无统计学意义(P>0.05)；2.在正常糖耐量者中，此多态C等位基因携带者空腹血糖水平高于T/T基因型者[5.00(4.69-5.28)mmol/L VS4.90(4.50-5.26)mmol/L P=0.035]：3.C等位基因携带者血清高密度脂蛋白胆固醇低于T/T基因型者(1.25±0.30mmol/L VS1.34±0.30mmol/L P=0.010)。 (2)对DsbA-L基因多态性与2型糖尿病关联研究发现：1.DsbA-L基因序列在外显子及侧翼内含子区未见单核苷酸多态性变异位点；2.位于DsbA-L基因5’非编码区的SNP-1308G/T(rs1917760)变异位点多态性频率及等位基因频率分布在正常糖耐量组和糖尿病组间及正常体重和超重/肥胖亚组间均无显著性差异；2.正常糖耐量及正常体重组中SNP-1308G/T(rs1917760)变异位点T等位基因携带者餐后胰岛素分泌水平，包括第一相和第二相胰岛素分泌，显著高于非T等位基因携带者(P=0.007；P=0.031)。多元逐步回归分析见到DsbA-L基因SNP-1308G/T(rs1917760)变异位点多态性在正常糖耐量及正常体重组中是第一相和第二相胰岛素分泌的独立相关因素(R2=0.055，P=0.007；R2=0.029，P=0.041)；3.在正常糖耐量及超重/肥胖组中SNP-1308G/T(rs1917760)变异位点T等位基因携带者的腹内脂肪面积显著高于非T等位基因携带者(P=0.020)。 应用小鼠胰岛B细胞株MIN-6细胞研究高糖培养对DsbA-L蛋白质表达的影响及DsbA-L对胰岛素分泌的作用，结果见到：1.MIN-6细胞中DsbA-L蛋白表达水平随着培养液中糖浓度的升高呈现先增加后减少的变化趋势，并且在高糖培养下MIN-6细胞中DsbA-L蛋白表达量随着培养时间的延长亦呈现先增加后减少的变化趋势；2.MIN-6细胞中DsbA-L过表达能增加MIN-6细胞葡萄糖刺激后胰岛素分泌水平，在低浓度葡萄糖(3.3mM)刺激时过表达组和对照组胰岛素分泌量差异有统计学意义(P=0.013)。 结论： (1)DUSP12基因SNP-6735T/C(rs1027702)变异位点与2型糖尿病及胰岛素抵抗参数无直接关联，但是与糖脂代谢参数有一定相关性。 (2)PsbA-L基因SNP-1308G/T(rs1917760)变异位点与2型糖尿病无直接关联，但该位点与胰岛素分泌及体脂分布有一定关联。 (3)DsbA-L蛋白表达可能受到葡萄糖培养环境的调节，慢性高糖环境可以减少其表达量。胰岛素成熟装配及分泌可能受到DsbA-L蛋白的调控。

目录

文摘

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论文说明：符号说明

声明

引言

第一部分葡萄糖激酶相关双特异性磷酸酶12基因多态性与中国人2型糖尿病的关系

引言

研究对象与方法

讨论

第二部分中国人DsbA-L与2型糖尿病的关系研究

引言

一、基因多态性研究对象与方法

二、MIN-6细胞中DsbA-L蛋白的初步研究

一、DsbA-L基因多态性研究结果

二、MIN-6细胞中DsbA-L蛋白的初步研究结果

三、DsbA-L过表达及葡萄糖刺激的胰岛素释放试验结果

讨论

结论

参考文献：

致谢

附录