顺铂和庆大霉素对小鼠耳蜗毛细胞的毒性作用

摘要

目的：⑴探讨顺铂不同给药途径对C57小鼠耳蜗毛细胞损伤的特点。⑵通过X连锁凋亡蛋白抑制因子(XIAP)过度表达对庆大霉素耳毒性的拮抗作用阐明庆大霉素耳毒性与耳蜗毛细胞凋亡的关系。 方法：①鼠龄2月的成年C57BL/6J小鼠随机分成5组：A组(n=6)耳蜗圆窗龛生理盐水给药5μl；B组(n=6)耳蜗圆窗龛顺铂给药5μl(1mg/ml)；C组(n=6)经鼓膜中耳腔顺铂一次性灌注0.1ml(1mg/ml)；D组(n=6)腹腔注射顺铂4mg kg-1·d-1*4d；E组(n=8)腹腔一次性注射顺铂15mg/kg。应用具有频率特性的听觉脑干诱发电位(ABR)和畸变产物耳声发射(DPOAE)检测5组动物给药前和给药后10天的ABR反应阈和畸变产物幅值(DP)，并以ABR反应阈和DP幅值为指标，评估各组动物各频率听觉灵敏度及耳蜗外毛细胞功能情况。所有动物在第二次测试ABR和DPOAE后处死，行耳蜗琥珀酸脱氢酶染色及耳蜗基底膜铺片，观察用药后毛细胞的形态学变化并绘制耳蜗毛细胞图。②应用耳蜗基底膜分离取材及耳蜗器官离体培养技术，取出生后2-3天的C57BL/6J小鼠耳蜗基底膜行离体耳蜗器官培养，经培养过夜后用不同浓度的庆大霉素培养液与离体基底膜共培养24或48小时。与0.1mM庆大霉素培养液共培养的部分基底膜培养24小时后，应用FAM-peptide-FMK标记的Caspase-3，Caspase-8，或Caspase-9指示剂作用1小时。再应用荧光标记的Phalloidin对全部耳蜗基底膜毛细胞的纤毛和表皮板进行染色。在荧光显微镜下定量观察不同浓度庆大霉素对耳蜗毛细胞的损伤规律及caspases的表达情况。最后再利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术对实验所用小鼠进行鉴定，区分同源野生型(Wild type，WT)小鼠和带有6-Myc标记的XIAP专基因(TG)小鼠，并进行两组间的比较。 结果：⑴全身应用顺铂的动物，各频率(2-32kHz) ABR反应阈及DP幅值用药前后无明显变化(P>0.05)，仅耳蜗基底膜钩端毛细胞中等程度缺失；中耳腔及圆窗龛局部给药导致从高频到低频的ABR反应阈明显升高和DP幅值明显降低(P<0.05)，毛细胞出现损伤、脱落，其损伤从顶回到底回有逐渐加重的趋势，外毛细胞较内毛细胞损伤更加严重，听功能的变化和耳蜗毛细胞病理损伤基本一致。⑵在离体培养条件下，过度表达的XIAP对耳蜗毛细胞存活无明显影响，野生型对照组和转基因型小鼠耳蜗毛细胞均生长良好，偶见内外毛细胞散在性缺失。庆大霉素对耳蜗毛细胞的损伤是剂量和时间依赖性的，随着培养液中庆大霉素浓度的增加和共培养时间的延长，野生型和转基因型小鼠耳蜗底回毛细胞缺失均逐渐向耳蜗项回扩展。庆大霉素与基底膜共培养24小时，转基因型小鼠与野生型对照小鼠耳蜗毛细胞损伤相似。0.1mM庆大霉素未引起耳蜗毛细胞的明显缺失；0.25mM庆大霉素主要损害耳蜗中底回的内外毛细胞，可引起全耳蜗约50％的内外毛细胞缺失；0.5mM庆大霉素可引起全耳蜗约70％的内外毛细胞缺损；1mM庆大霉素造成超过90％的内外毛细胞破坏。庆大霉素与基底膜共培养48小时，0.1mM庆大霉素引起野生型小鼠耳蜗中回约30％的毛细胞缺失以及耳蜗底回约60％的毛细胞缺失，而转基因型小鼠耳蜗中回毛细胞缺失约15％，耳蜗底回毛细胞缺失约30％，两型小鼠毛细胞存活数差异具有统计学意义(P<0.05)；0.2mM硫酸庆大霉素引起的野生型和转基因型小鼠毛细胞损失相似，底回毛细胞缺失近100％，顶回毛细胞缺失约20％。基底膜与0.1mM庆大霉素共培养24小时主要引起Caspase-3，9的表达，过度表达的XIAP对caspase-3，9的表达有抑制作用。 结论：①顺铂不同给药途径导致C57小鼠耳蜗毛细胞损伤的特点各不相同。根据损伤特点的不同，中耳腔和圆窗龛局部给药途径可以用来建立顺铂诱发小鼠耳聋模型，但中耳腔给药由于容易破坏中耳结构而损伤听力，因此，在只关注内耳形态学改变的实验中可以作为备选。②庆大霉素通过caspase途径参与了耳蜗毛细胞凋亡的损伤，过度表达的XIAP可以拮抗庆大霉素的耳毒性，从而对耳蜗毛细胞起到部分保护作用。庆大霉素诱导的耳蜗毛细胞损伤，可能有非caspase凋亡途径或细胞坏死机制的参与。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:中英文缩写对照

声明

第一部分顺铂不同给药途径对C57小鼠耳蜗毛细胞损害的实验研究

1引言

2 材料和方法

2.1实验动物及其分组

2.2主要实验试剂

2.3主要实验器材

2.4实验方法

3结果

3.1给药前后体重变化情况

3.2给药前后中耳情况

3.3给药前后ABR阈值变化情况

3.4给药前后DPOAE信噪比变化情况

3.5给药后耳蜗毛细胞损害

3.6给药后肾脏病理损害

4讨论

5参考文献

第二部分庆大霉素耳毒性与耳蜗毛细胞凋亡关系的实验研究

1前言

2材料和方法

2.1实验动物及来源

2.2主要实验试剂

2.3主要实验器材

2.4实验方法

3结果

3.1 WT和TG小鼠耳蜗基底膜庆大霉素共培养24小时

3.2 WT和TG小鼠耳蜗基底膜庆大霉素共培养48小时

3.3 Caspase-3，-8，-9的表达

4讨论

5参考文献

综述一XIP与顺铂诱导的感音神经性聋

综述二铜及铜转运蛋白与顺帕耳毒性防治展望

致谢

附录 攻读博士期间发表或录用的论文/会议摘要