多氧霉素生物合成机理及其代谢工程研究

摘要

多氧霉素(Polyoxin，POL)是重要的肽基核苷类抗生素，由于其对农作物、果蔬及一些经济植物真菌病害有良好防治作用，加之对环境友好，故自创制成功便在农业上大规模推广使用；迄今为止，多氧霉素仍是世界上投产与使用最广泛且未产生耐药性的农用抗生素之一。多氧霉素的化学结构由核苷骨架及两个后修饰氨基酸组成，其与几丁质的合成单元UDP-N-乙酰葡萄糖胺的结构相似，因此为几丁质合成酶的强烈竞争性抑制剂。鉴于多氧霉素独特的化学结构与作用机理，科学家们长期以来对其表现出浓厚的研究兴趣，但其生物合成机理一直悬而未决。本研究旨在从分子水平上阐明多氧霉素独特的生物合成机理，从而为利用代谢工程策略对多氧霉素产生菌株进行分子改良，同时也为利用组合生物学手段产生具有更高生物活性的多氧霉素衍生物奠定理论基础。
　　 以nikkomycin生物合成基因nik0出发，通过PCR扩增到探针，进而从S. cacaoi基因组文库中克隆出多氧霉素的整个生物合成基因簇，同时对阳性cosmid SA7进行改造，成功实现多氧霉素在异源宿主S.lividansTK24中的工程化产生。生物信息学分析显示测定的46-kb区域含有39个ORF，其中多氧霉素生物合成基因簇由16个结构基因，2个调控基因及2个膜蛋白相关基因组成。采用在cosmid上直接同框缺失目标基因和异源表达策略，确定出三个基因(poIF，poIC和poIE)负责POIA的生物合成，同时鉴定出poIL，poIN和poIM与CPOAA的生物合成相关。以此为基础结合生物信息学分析成功推断出多氧霉素的整个生物合成途径，并对早期推断的生物合成途径进行了修正。
　　 PoIA与NikO具有较高同源性，PolO与氨甲酰转移酶具有较高同源性；体内实验证明，poIA和polO与多氧霉素的生物合成直接相关，poIA突变株可以分别被poIA和nikO互补，但互补菌株产生的POL组分表现差异，暗示PoIA与NikO具有不同的底物偏好性。体外实验证明，PolO为O-氨甲酰转移酶；而PoIA与NikO为UMP烯醇式丙酮酰转移酶，二者催化功能一致，但表现出不同的催化效率，这与体内互补实验一致。
　　 PolB与胸苷酸合酶ThyX有较高同源性，研究揭示：poIB突变株主要积累POL-K组分，而野生型主要产生POL-A与POL-H组分，三者区别在于前者的核苷骨架含有C-5甲基化修饰，说明polB与该修饰直接相关，同时发现POL-K具有更高生物活性。S.cacaoi的thyX突变株在基本培养基上表现出零星生长表型，暗示该表型由poIB赋予；研究发现polB和thyX双突变菌株在MM培养基上丧失生长表型，但可被poIB和thyX互补。进一步研究显示，polB可互补S.coelicolor的thyX突变株和E. coli的thyA突变株(CHI)恢复生长表型；不仅如此，CHI/poIB互补菌株对TMP产生抗性表型，说明PolB与ThyA具有不同催化机制。体外研究揭示PoIB含有的辅因子为FAD，并且PoIB为迄今发现的首例UMP甲基化酶，其能利用UMP与dUMP为底物生成相应产物，这与体外实验高度一致。
　　 PoIP与精氨酸生物合成蛋白ArgB有较高同源性，研究发现poIP突变株仍有多氧霉素活性组分的部分产生能力，推测此表型可能由argB赋予。进一步研究显示，argB为精氨酸和多氧霉素的生物合成所必需，换言之，argB突变株同时丧失精氨酸和多氧霉素的产生能力，但该突变株可被argB和poIP互补，说明在S.cacaoi中精氨酸与多氧霉素的生物合成间存在间接调控网络，具体分子调控机理的阐明正在进行之中。
　　 多氧霉素的三个构造单元独立合成，然后推测在PolG(ATP依赖的酰胺合成酶)的作用下进行组装。研究显示，poIG同框缺失菌株直接积累POL-I和thymine POL-I组分，而poIG互补突变株恢复野生型表型，说明poIG只负责一个酰胺键的生物合成，另一个酰胺键的生物合成机理有待进一步研究。
　　 同时本研究以多氧霉素工业菌株为研究材料，构建成其基因组文库，并成功克隆出多氧霉素生物合成基因簇，序列比较分析显示S. cacaoi与工业菌株中的多氧霉素生物合成基因簇的序列与遗传结构高度一致。此外，通过对工业菌株进行代谢工程改造，成功构建成POL-B，POL-K及POL-L等单组分高产菌株，为进一步工业化应用奠定了坚实的基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:符号说明

声明

第一章 绪论

第一节 前言

第二节 抗生素生物合成基因簇的克隆策略

第三节 核苷类抗生素代谢工程的研究进展

第四节 多氧霉素生物合成的研究进展

第五节 国内外农用抗生素的研究概况与展望

第六节 本课题研究目的与意义

第二章 材料与方法

第一节 实验材料

第二节 实验方法

第三章 多氧霉素生物合成基因簇的克隆与鉴定

第一节 多氧霉素生物合成基因簇的克隆

第二节 多氧霉素在变铅青链霉菌TK24中的异源工程化产生

第四章 多氧霉素生物合成基因簇的序列测定与功能分析

第一节 多氧霉素生物合成基因簇的序列测定

第二节 多氧霉素生物合成基因簇边界的确定

第三节 多氧霉素生物合成基因簇的功能分析

第五章 多氧霉素生物合成途径的推断

第一节 核苷骨架生物合成途径的推断

第二节 后修饰氨基酸生物合成途径的推断及多氧霉素生物合成单元的组装

第六章 多氧霉素生物合成基因polA与polO的功能研究

第一节 多氧霉素生物合成基因polA的功能研究

第二节多氧霉素生物合成基因polO的功能研究

第七章 多氧霉素生物合成基因polB的功能研究

第一节 研究背景介绍

第二节 polB的体内功能研究

第三节 polB的体外功能研究

第八章 多氧霉素生物合成基因polP，polN及polG的功能研究

第一节 研究背景介绍

第二节 polP的体内功能研究

第三节 polN功能的初步研究

第四节 polG的体内功能研究

第九章 工业菌株中多氧霉素生物合成基因簇的克隆、序列测定及比较分析

第一节 工业菌株中多氧霉素生物合成基因簇的克隆与序列测定

第二节 工业菌株中多氧霉素生物合成基因簇的比较分析

第十章 利用代谢工程策略改造多氧霉素工业菌株的探究

第一节 polyoxin K组分高产菌株的构建及应用

第二节 polyoxin B组分和L组分高产菌株的构建及应用

第三节 polyoxin生物合成基因簇在工业菌株中的人工扩增

第十一章 总结与展望

第一节 本研究总结与主要创新点

第二节 研究展望

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文和申请专利及获得奖励

致谢