长春花萜类吲哚生物碱合成途径重要基因及转录因子功能研究

摘要

长春花(Catharanthus roseus L.G.Don)萜类吲哚生物碱(Terpenoid indolealkaloids，TIAs)的生物合成途径是一个由众多生化反应步骤构成的复杂代谢网络，受到严格调控。目前已经克隆的长春花TIAs合成途径相关的基因和转录因子基因数量超过了三十个，有关的酶和基因研究工作也开展了多年，TIAs合成途径的大体路径基本清晰，但是现在对于调控TIAs合成的关键酶仍然不清楚。迄今为止，还没有一个在相同的实验条件下所做的基因表达的专门比较实验报道。针对这种状况，本研究首次开展了在相同实验条件下的基因表达比较的实验工作。我们以生长旺盛的观赏兼药用植物长春花无菌苗为遗传转化材料，选择长春花吲哚生物碱(TIAs)生物合成途径上六个重要酶(DXR，G10H，STR，TDC，DAT，PRX1)为研究对象，根据它们的已知基因序列分别构建了六个单转植物表达载体(pCAMBIA1304++gene)；另外，还选择与TIAs合成有关的两个转录因子(ORCA2，ORCA3)，根据其基因序列分别构建了两个单转植物表达载体(pCAMBIA1304++gene)和一个共转植物表达载体(pCAMBIA1304％ Orca2+Orca3)，以发根农杆菌C58CI为介导，通过这八个基因的单独转化和两个转录因子基因的共转化，分别得到了大量单/共转基因毛状根系。经过转基因毛状根系的抗性筛选、毛状根样品的分子生物学检测与验证、用荧光定量PCR(FQ-PCR)技术测定转基因毛状根中基因的相对表达水平、以及用高效液相色谱(HPLC)技术检测转基因毛状根中长春质碱和文多灵的含量，分别得到了检测结果。
　　 通过检测基因的相对表达水平，能够验证转基因的表达与否，从而筛选出转基因的阳性样品做为检测TIAs含量的材料；同时分析单转转录因子基因毛状根中结构基因的相对表达量，判断哪些结构基因的表达受到转录因子的调控，从而寻找转录因子的调控靶基因。通过检测转化毛状根中TIAs的含量变化，能够确定究竟那些酶才是真正调控TIAs合成的关键酶，进而为指导长春花次生代谢工程研究提供理论依据。因此，本研究的实验目的是：1）筛选长春花细胞中控制TIAs生物合成的关键酶；2）寻找重要转录因子的新的调控靶基因。本研究得到以下结果：
　　 1.DXR、STR分别是TIAs合成途径上、中游的关键酶。通过HPLC方法检测六个单转结构基因和两个单转转录因子基因，以及一个共转的毛状根样品中长春质碱和文多灵含量，结果证明：与实验对照组(即C58CI，平均含量为2.77±0.652 mg/g DW)相比较，六个转基因毛状根样品的长春质碱含量都有提高，其中单转Str基因毛状根中长春质碱平均含量最高(6.579±0.711 mg/g DW)，单转Tdc基因和Dat基因毛状根中长春质碱平均含量为最低（平均含量分别为3.177±0.623 mg/g DW、3.488±0.696 mg/g DW,）。文多灵含量的检测结果是：单转Dxr基因和Prxl基因毛状根中的文多灵平均含量高于其它4种单转基因毛状根样品，而单转Dat基因和Tdc基因的毛状根中文多灵平均含量较低(平均含量分别为0.0414-0.0073 mg/g DW、0.044±0.0091 mg/g DW,)，几乎与实验对照C58C1(平均含量为0.0375±0.007 mg/g DW)相同。因此，就合成长春质碱和文多灵而言，DXR、STR分别是TIAs合成途径上、中游的关键酶，而G10H并没有学术界所预期的那么重要，我们推论GIOH可能在一定的条件下才具有重要作用。
　　 2.PRX1是TIAs合成途径下游的一个关键酶。用FQ--PCR方法检测单转Orca3基因的毛状根样品，在所有检测的各个基因中，Prxl基因的表达量最高，相对表达量平均达到12.18±1.442，远远高于其它基因的表达量，如此高的Prxl基因表达量，说明ORCA3能够通过调控Prxl基因表达水平，进而调控TIAs合成途径下游的合成速度。另一方面，HPLC检测结果证明，单转Prxl基因毛状根样品中的长春质碱和文多灵含量都有明显高于对照组样品，尤其是文多灵的含量在六种转基因毛状根样品中达到最大，为0.1043±0.017 mg/g DW。因此，我们认为PRX1是TIAs合成途径下游的一个关键酶。
　　 3.G10h很可能是ORCA2的调控靶基因。用PO-PCR方法检测8个Orca2转基因毛状根样品的相对基因表达量，都得到了几乎一致的检测数据，平均相对表达量为1.642±0.288（即GlOh基因的表达量比实验对照高出1.64倍）。而在检测的8个0rca3转基因毛状根样品中，GlOh的平均相对表达量仅为0.57士0.093。从检测的结果分析，在0rca2和0rca3转基因毛状根样品的相对表达量都不高。
　　 4.Lamt和S1s基因的表达受到0RCA2和ORCA3的共同调控。经过P-PCR方法检测，结果表明Lamt基因在单转Orca单转Orca3因毛状根样品中的相对表达量平均分别为2.8±0.634和7.437±0.632，而S1s基因在这两种样品中的相对表达量平均分别是3.55士0.76和3.265士1.06。这说明Lamt和S1s基因的表达量明显受到ORCA2和ORCA3的共同调控。
　　 5.Hmgr表达受到ORCA3调控。FQ-PCR检测结果为：Hmg在Orca2 Orca3转基因毛状根中的相对表达量分别为1.37±0.42和6.64±1.21。这表明Hmgz的表达强烈受到转录因子ORCA3调控。这个实验结果提示我们，ORCA3转录因子既能调控TIAs合成途径上游的MEP途径，保证TIAs的正常合成；同时，还通过调控Hgr基因的表达而简单有效地调控MVA途径，使得这两条代谢途径有机地联系起来。
　　 6.通过HPLC方法检测转录因子基因的转化毛状根样品，结果证明转录因子ORCA2和ORCA3能够明显促进长春花毛状根细胞合成长春质碱和文多灵。