18α-甘草次酸对人和大鼠肝星状细胞生物学活性及TGF-β1/Smad信号通路的影响

摘要

本文从以下三个部分来展开论述：
　　 第一章18α-甘草次酸对人和大鼠肝星状细胞增殖和凋亡的影响
　　 目的：观察18α-甘草次酸(18α-GA)对人和大鼠肝星状细胞增殖和凋亡的影响并探索其分子机制。
　　 方法：首先通过细胞活力检测试剂盒确定18α-GA的干预浓度。然后采用细胞计数分别观察18α-GA对人和大鼠肝星状细胞生长曲线的影响。用流式细胞仪检测18α-GA干预后细胞周期和凋亡的变化，并同时应用PPARγ特异性阻断剂GW9662在药物干预前作用于细胞。采用real time PCR和western blot检测18α-GA干预前后PPARγ表达的变化。采用western blot测定细胞周期和凋亡相关蛋白表达的变化。最后采用Arraystar转录因子活性ELISA检测法检测18α-GA干预前后NF-κB与DNA结合活性的变化。
　　 结果：18α-GA在干预48h和72h后可抑制人和大鼠肝星状细胞株的增殖。18α-GA干预后，肝星状细胞株G0/G1期细胞数明显增加，S期细胞数明显减少，与对照组相比具有显著统计学意义(p<0.01)；而且细胞凋亡率在18α-GA干预后也显著增加(p<0.05)，而Gw9662可消除上述作用。18α-GA可上调PPARγ的mRNA和蛋白表达水平。此外，18α-GA干预后，细胞周期蛋白D1表达减少，p27表达增加；抗凋亡蛋白bcl-xl、bfl/Al表达减少，促凋亡蛋白bax表达增加；NF-κB与DNA的结合活性也受到抑制；而GW9662可消除18α-GA的上述作用。
　　 结论：18α-GA可抑制人和大鼠肝星状细胞的增殖并促进其凋亡。PPARγ的表达上调或激活，引起的NF-κB与DNA的结合活性被抑制及细胞周期及凋亡相关蛋白表达的变化可能参与了这一过程。
　　 第二章18α-甘草次酸对人和大鼠肝星状细胞TGF-β1/Smad
　　 目的：观察18α-甘草次酸(18α-GA)对肝星状细胞TGF-β1/Smad信号通路的影响。
　　 方法：首先通过real time RCR方法观察18α-GA对TGF-β1/Smad信号通路相关基因表达的影响，接着采用western blot技术对上述基因的蛋白表达水平进行验证，最后应用免疫细胞化学方法观察蛋白活性形式-磷酸化Smad2和Smad3的表达变化。
　　 结果：18α-GA在干预24h和48h后可显著抑制人和大鼠肝星状细胞Smad3及Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA和蛋白的表达(p<0.05)，增加Smad7的表达(p<0.05)，并能显著减少Smad3的活性形式一磷酸化Smad3的表达。
　　 结论：18α-GA可抑制人和大鼠肝星状细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA和蛋白的表达，这一作用可能是通过18α-GA直接或间接下调Smad3和上调Smad7实现的。
　　 第三章18α-甘草次酸对人和大鼠肝星状细胞转录因子活性的影响
　　 目的：观察18α-甘草次酸(18α-GA)对肝星状细胞转录因子活性的影响。
　　 方法：采用电泳迁移率试验(EMSA)和ArrayStar转录因子活性ELISA检测法两种技术分别检测18α-GA干预前后，肝星状细胞转录因子特异蛋白-1(SP-1)、激活蛋白(AP-1)和核因子-κB(NF-κB)与DNA结合活性的变化。
　　 结果：18α-GA在干预24h后可显著抑制人和大鼠肝星状细胞SP-1、AP-1、NF-κB与DNA的结合活性，且随着干预时间延长三种转录因子的DNA结合活性逐渐下降，在48h转录因子的DNA结合活性最低，呈时间依赖性，其中对SP-1的抑制最显著。
　　 结论：18α-GA可抑制人和大鼠肝星状细胞SP-1、AP-1、NF-κB与DNA的结合活性，这可能是18α-GA抑制细胞外基质表达的一个机制。