重组全长人釉原蛋白制备及其细胞生物学作用评价的实验研究

摘要

目的:牙周组织再生是临床牙周治疗的终极目标,尽管釉基质蛋白(Enamelmatrix proteins,EMPs)能够诱导实现牙周组织的功能性重建,但现有商品化的猪EMPs存在着来源限制及其他成分干扰等诸多问题。近年来有研究提出EMPs的主要成分釉原蛋白(amelogenin,Am)是其诱导牙周组织再生的关键,有望替代EMPs用于牙周组织再生。然而,对单一成分Am的细胞生物学活性及其与EMPs的比较目前还缺乏系统研究,而Am本身异质性和表达的时空特异性使其单一组分的提取纯化极为困难,因此,本课题拟分别纯化原核大肠杆菌和真核毕赤酵母表达的重组全长人釉原蛋白(rhAm175),比较不同来源的rhAm175与天然EMPs对人牙周膜成纤维细胞(Periodontal ligament fibroblasts,PDLFs)生物学作用的差异。初步探讨rhAm175促进牙周组织再生的作用和可能机制,为rhAm175代替EMPs用于牙周组织再生提供实验依据。
　　方法:将全长人Am编码序列分别插入选择原核表达载体pET28a或真核表达载体pPIC3.5K中,重组表达质粒转化E.coli BL21(DE3)和P.pastoris GS115(Mut+)感受态细胞后筛选阳性克隆。诱导表达的重组全长人釉原蛋白(E-rhAm175和Y-rhAm175)通过镍柱亲和层析纯化,并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(WB)鉴定。乙酸法提纯猪釉基质蛋白(pEMPs)。比较E-rhAm175、Y-rhAm175和pEMPs对体外培养人牙周膜成纤维细胞粘附、迁移、增殖和分化的影响,并分析可能参与这些细胞生物学作用的细胞内信号分子——细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal response kinase,ERK1/2)和Akt激酶(Akt kinases/protein kinase B,Akt/PKB)的活化情况。
　　结果:1、分别在E.coli BL21(DE3)和P.Pastoris GS115(Mut+)细胞中成功表达E-rhAm175和Y-rhAm175,通过亲和层析法获得纯化的重组蛋白,经SDS-PAGE和WB鉴定为全长人釉原蛋白。2、10 ug/ml和20ug/ml的E-rhAm175或Y-rhAm175均能显著促进hPDLFs黏附、迁移和增殖,抑制成骨分化标志物(ALP、OCN、COL I、Runx2)的mRNA表达水平,其作用与200ug/ml pEMPs之间无明显差异。3、E.rhAm175、Y-rhAm175或pEMPs均通过激活ERK1/2促进hPDLFs的DNA合成,进而发挥促增殖的作用。而Akt激酶不参与rhAm175或pEMPs对hPDLFs生物学特性的影响。
　　结论:重组全长人釉原蛋白rhAm175与pEMPs对hPDLFs具有相似的细胞生物学作用。单一成分的rhAm175可通过与pEMPs相同的方式作用于hPDLFs,从而参与促进牙周组织的修复和再生。