保留胫骨残端重建ACL对膝关节本体感觉影响及相关机制的实验研究

摘要

本体感觉在前交叉韧带(anterior cruciate ligament,ACL)损伤重建后膝关节功能恢复中的作用日益受到重视。理论上关节镜下保留胫骨残端重建ACL有益于本体感觉的重建,但有关其本体感受器再生过程、大脑皮层功能重塑变化规律及其机制,未见相关报道。本研究通过采用免疫组化技术、分子生物学技术与神经电生理技术,拟揭示保留残端对韧带本体感受器再生的意义与变化规律、韧带重塑相关基因时空表达模式、本体感觉神经元再生的变化规律及相关机制、大脑皮层投射区域重塑的模式及其再生的分子机制。
　　目的：
　　1.观察保留残端重建ACL对本体感受器的影响;2.观察保留残端重建ACL对韧带重塑相关基因表达的影响;3.探讨保留残端重建ACL对本体感觉神经元的影响及相关机制;4.探讨保留残端重建ACL对中枢可塑性的影响及相关机制。
　　方法
　　1.采用免疫组织化学方法,比较保留与不保留残端重建ACL后不同时间点本体感受器的变化;
　　2.通过实时定量RT-PCR方法,比较保留与不保留残端重建ACL后不同时间点VEGF、TGF-β1、COLIAI、COL3A1、GAP-43、NT-3 mRNA的时相表达模式;
　　3.建立保留与不保留残端重建ACL模型,于术后不同时间点行荧光金逆行示踪标记观察保留残端对本体感觉神经元再支配的影响;行实时定量荧光PCR及Western blotting观察保留残端对NT-3、TrkC、Runx3基因与蛋白水平的影响。
　　4.建立保留与不保留残端重建ACL模型,于术后不同时间点行体表诱发电位,实时定量荧光PCR及Western blotting观察保留残端对神经电生理与GAP-43基因与蛋白水平的影响。
　　结果
　　1.术后6周,12周两组Pacinian小体数目低于正常对照组(P＜0.05),术后12周保留与不保留残端组Pacinian小体之间显著性差异(P=0.032)。术后24周,各组之间比较无统计学意义(P＞0.05)
　　2.与不保留残端组相比,保留残端组COL I A1,COL3A1,TGF-β1,GAP-43 mRNA在术后6周有显著性差别(P＜0.05);VEGF mRNA表达术后12周显著增加(P＜0.05);NT-3 mRNA表达术后2周,12周显著增加(P＜0.05)。
　　3.术后6周至24周,保留与不保留残端组FG阳性感觉神经元不断增多;术后6周,保留残端组FG标记阳性的感觉神经元数目显著高于不保留残端组(P＜0.001);术后24周,两组FG阳性感觉神经元数目达到峰值。两组各时间点FG感觉神经元数目与正常对照组存在显著性差异(P＜0.05)。
　　4.NT-3,trkC,Runx3 mRNA时相表达模式基本一致,均出现先增高后逐渐降低的趋势;ACL重建后早期,保留残端组NT-3,trkC,Runx3 mRNA表达与不保留残端之间有显著性差异(P＜0.05),NT-3,trkC,Runx3 mRNA与蛋白表达趋势相一致。
　　5.术后3周,6周时刺激保留与不保留残端组移植物未检查到SEPs,术后12周时刺激移植物时10只新西兰兔有3只出现不典型的SEPs,潜伏期与正常SEP有显著性差别(P＜0.05),术后24周SEPs的潜伏期逐渐缩短,仍与正常的SEPs有统计学差异(P＜0.05)。
　　6.与正常对照组相比,不保留残端组与保留残端组GAP-43 mRNA表达水平变化相似,均于术后第6周达到峰值,术后6周表达显著下降(P＜0.05)。与不保留残端组相比,保留残端组GAP-43 mRNA表达水平在术后第3周,6周,第12周呈显著增加(P＜0.05)。GAP-43 mRNA与蛋白表达趋势相一致。
　　结论
　　1.保留残端重建ACL可短期内促进本体感受器的再生。
　　2.ACL移植中促进血管生成,修复和神经相关基因的mRNA水平增加并存在时间依赖性,保留残端组的某些时间点促进相关基因的表达。
　　3.ACL重建后,NT-3、TrkC、Runx3参与了DRG中本体感觉神经元的修复与再生,保留残端重建ACL可在早期促进内源性NT-3、TrkC与Runx3的表达。
　　4.NT-3,TrkC与Runx3的时相表达规律存在差异,其作用方式可能也存在一定差异。
　　5.保留残端重建ACL对大脑皮层GAP-43的表达存在时间依赖性,并在早期促进其表达。