HBV-P区预存突变的流行病学研究及其对初治慢性乙型肝炎患者免疫应答的影响

摘要

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)引起的危害人类健康的最常见的传染病之一。HBV病毒复制过程以RNA为中间体，参与病毒复制的由HBV-P区基因编码的RNA聚合酶/逆转录酶（HBV Pol）在逆转录过程缺乏严格的校正功能，所以造成病毒复制过程中出现自发突变的频率大大升高，导致乙型肝炎患者体内 HBV病毒产生突变的可能性大大增加。这些未经药物治疗而在患者体内检测到的突变位点（我们将其称为预存突变）的分布如何、临床流行病学特征及其潜在的临床意义是本论文的主要研究目标。
　　本研究采用 PCR测序的方法回顾性分析168例慢性乙型肝炎初治患者中HBV病毒的基因型和HBV聚合酶区（HBV-P）预存突变，并进一步分析了预存突变的临床流行病学特征。结果显示168例慢性乙型肝炎初治患者中有43例检测到HBV-P区预存突变，检出率为25.6％，突变位点均不在已知核苷（酸）类药物的耐药位点之列。HBV-P区预存突变组和非突变组在病毒基因型、年龄和性别的分布无明显差异，起病时HBeAg阳性比例、ALT水平和血清基线HBV DNA水平在两组间亦未发现统计学差异。168例初治患者中HBeAg阴性人群较HBeAg阳性人群的基线HBV DNA水平显著减低（P=0.0112）；其中HBV-P区预存突变患者基线HBV DNA水平减低明显，是造成HBeAg阴性患者基线HBV DNA水平和高病毒拷贝数患者的比例明显低于HBeAg阳性人群的主要原因。上述研究结果提示HBV-P区预存突变降低慢性乙型肝炎初治患者HBeAg阴性人群的病毒复制水平，对该人群组预存突变的分析有可能成为临床分类分组的新指标之一，在进一步分析预存突变存在和疗效关系的基础上，有可能需要根据预存突变对不同乙型肝炎患者采取不同的治疗方案。
　　为进一步研究乙型肝炎初治患者预存突变对免疫应答的影响，我们首先比较分析了急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎初治和乙型肝炎后肝硬化患者CD8+T淋巴细胞在数量和免疫记忆应答水平上的差异。研究结果表明不同类型乙型肝炎患者外周CD8+记忆性T淋巴细胞在数量和应答水平上呈现出不同的格局，和正常人群相比，三个不同阶段乙型肝炎患者外周未致敏CD8+T淋巴细胞的比例均显著降低，而CD45RA-CD8+记忆/活化型 T淋巴细胞的比例则显著增高，而且在肝硬化阶段未致敏细胞比例降低更为明显，记忆/活化细胞比例升高更为明显，表明在肝硬化阶段，大多数外周CD8+T淋巴细胞具有向记忆/活化型细胞分化的趋势；同时和慢性乙型肝炎初治患者相比，肝硬化阶段外周CD8+T淋巴细胞不仅在数量上显著减少，同时在功能上也呈现低反应性，其分泌 IFN-??的能力也基本丧失。上述结果表明，不同临床阶段乙型肝炎患者中CD8+T淋巴细胞免疫应答（和记忆应答）呈现不同的状态，在免疫清除阶段，患者CD8+T或是记忆性CD8+T淋巴细胞仍然具有一定的有效应答能力，当发展至肝硬化阶段，CD8+T淋巴细胞功能则明显降低。这种细胞功能的丧失与病毒清除能力减低及疾病的慢性化进展可能存在一定关联,提高慢性乙型肝炎患者中免疫记忆/活化型CD8+T淋巴细胞的比例和功能可能成为延缓肝硬化和肝衰竭的有效途径。
　　利用上述研究结果，我们进一步对其中19例初治慢性乙型肝炎患者外周HBV病毒的基因型和HBV-P区序列进行分析，并结合患者的免疫应答水平，进一步探讨HBV-P区预存突变对宿主免疫应答的影响，进而影响HBV DNA水平等病毒学特征。初步研究结果显示发生HBV-P区预存突变的患者，其病毒复制水平与记忆/效应 T淋巴细胞呈负相关，同时与初始未致敏 T淋巴细胞呈正相关。上述结果提示 HBV-P区预存突变患者DNA水平的降低与外周初始未致敏免疫细胞向效应细胞的分化有一定关联，HBV-P区预存突变由此有可能成为HBV初治患者临床分型和治疗的一个新候选指标。

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缩略词

第一章 绪论

1.1 乙型肝炎病毒分子生物学特征

1.2 乙型肝炎病毒的致病性和免疫性

1.3 慢性乙型肝炎病毒感染患者的临床分类、治疗和预后影响因素

1.4 本论文的研究目的和意义

第二章 初治慢性乙型肝炎患者HBV-P区预存突变的流行病学研究

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

第三章 不同临床阶段乙型肝炎患者外周CD8+T淋巴细胞免疫记忆应答水平比较研究

3.1 材料

3.2 方法和步骤

3.3 结果

3.4 讨论

第四章 HBV-P区预存突变对初治慢性乙型肝炎患者免疫应答水平的影响

4.1 材料

4.2 方法和步骤

4.3 结果

4.4 讨论

全 文 总 结

参考文献

致谢

攻读硕士期间完成的文章