结核分枝杆菌抗原特异性体液免疫应答的筛查及其临床意义初探

摘要

结核病（tuberculosis，TB）主要是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M. tb）感染引起的传染性疾病，病原菌主要通过空气经呼吸道传播。结核病是目前仅次于AIDS的第二大传染病杀手，2012年数据统计结果显示全球新发结核病患者达870万之多，死于结核病人数达140万；中国是全世界结核病高负担的国家之一，2011年新增结核病人数达90~110万，仅次于印度位居世界第二[1]。因此，结核病的国内外防控形势非常严峻。
　　为更有效地控制结核病的传播以及降低其发病率和致死率,我们不仅需要具有免疫保护作用的疫苗，及时准确的诊断技术和优化的治疗方案也是结核病防控的重要环节。然而，目前上述三个方面都存在缺陷和发展瓶颈：BCG疫苗是目前唯一批准使用的结核病预防性疫苗，其使用已经超过一百年，虽然至今仍在使用，但其只对儿童起保护作用，而无法控制结核病在成年人之间的传播，保护效果存在很大局限性；当前结核病的治疗药物基本是在上世纪初发展起来的抗菌药物，特异性差，治疗时间长，且副作用大，并随着耐药结核的出现，药物治疗效果日益受到挑战；结核病是目前临床上诊断最为复杂的疾病之一,现有临床诊断技术在准确性和及时性上仍显不足，痰涂片抗酸染色法(sputum smear microscopy)只有在患者痰液中 M.tb含量很高的时候才能检测为阳性，因此很容易出现假阴性；痰结核菌培养法（sputum culture test）能提供更高的准确性，但此法周期长（三周至两个月），可能延误治疗；基于迟发型超敏反应的PPD皮试试验则由于受检者接种过BCG而出现假阳性，也很难区分潜伏感染和活动期结核病。因此，结核病在预防、诊断和治疗方面都需得到进一步提高。
　　抗M.tb感染免疫应答中，细胞免疫应答发挥关键作用，而体液免疫应答的作用则存在争议。然而越来越多的证据表明，体液免疫应答在抗M.tb感染中具有重要作用。探讨M.tb感染引起的抗原特异性体液免疫应答格局不仅能为体液免疫应答在抗 M.tb感染中的作用提供证据，还将为新疫苗的开发、新型诊断标志物的筛选以及生物免疫治疗方案等研究提供新的候选分子。
　　本研究中，我们利用生物信息学分析等方法，筛选和获得多个膜型或是分泌型结核分枝杆菌病原蛋白，通过原核系统表达并纯化其中39个M.tb蛋白质抗原，通过间接ELISA试验比较检测了活动期结核病患者与健康人群对照组血浆中抗原特异性IgG、IgM和IgA的水平。39个抗原特异性IgG水平的检测结果显示，活动期结核病患者体内的抗原特异性 IgG水平普遍高于健康对照组，其中28个抗原的IgG水平升高存在显著性差异；对22个抗原特异性IgA水平检测结果显示，其中20个抗原特异性IgA水平在活动期结核病患者与健康对照组相比，存在显著性升高；对10个抗原的特异性IgM水平检测结果显示，活动期结核病患者的抗原特异性IgM水平普遍则低于健康对照组，其中7个抗原的IgM水平在患者中减低具有显著性差异。上述结果表明，活动期结核病患者中代表初次免疫应答的病原菌抗原特异性IgM水平明显低于正常对照，而再次应答产生的特异性IgG和IgA的水平在两组人群中比例则表现为患者高于正常人，由此反映出活动期结核病患者中产生的结核分枝杆菌特异性免疫应答和再次免疫应答相关联，这可能与这些活动期患者的结核分枝杆菌持续感染密切相关。对存在显著性差异的结核分枝杆菌抗原特异性的IgG和IgA水平进行ROC分析，结果显示Rv0440（HSP65）和Rv3841的IgG检测灵敏度达90％，特异性达90%，ROC曲线的AUC值分别达0.965和0.966，上述指标均与目前临床上使用的抗38KD（Rv0934）蛋白的IgG水平相当；部分抗38KD IgG抗体阴性的结核病患者中抗HSP65 IgG抗体水平呈现阳性，提示抗HSP65 IgG可以成为目前商业化抗38KDIgG检测的补充，从而进一步提高结核病诊断的灵敏度。
　　我们进一步结合活动期结核病患者的临床资料初步分析了患者的体液免疫应答与临床表现的关系，比较分析发现，空洞阳性患者抗Rv0440的IgG水平，抗Rv1837c、Rv1860、Rv0733和 Rv3841的 IgA水平显著高于空洞阴性患者；抗酸染色阳性患者抗 Rv2626c、Rv1980c、Rv3875和Rv3841的IgM水平显著高于抗酸染色阴性患者。
　　我们同时还比较活动期结核病人对上述部分结合分枝杆菌抗原的体液免疫应答与细胞免疫应答间的相关性，从而为深入了解体液免疫应答与细胞免疫协同参与抗 M.tb感染的作用方式。为此，我们利用实验室已经获得的特异性抗原刺激下的IFNγ-ELISPOT试验数据代表抗原特异性T细胞免疫应答，分析结核病患者对同一抗原的抗体水平和释放IFNγ的T细胞频率之间的关联，结果显示特异性 IgG抗体水平与同一抗原刺激下的分泌 IFNγ的 T细胞频率间呈负相关性、无相关性或正相关性的抗原分别占1/3左右，而大部分抗原的IgA水平与T细胞应答水平则呈现一定的负相关性。由于IgA是黏膜局部免疫应答产生的主要抗体分子，并进一步分布于外周，部分病原特异性IgA水平在患者外周的显著升高一方面提示与感染局部免疫应答升高有关，其与外周特异性 T细胞应答水平的负相关则提示在针对部分病原菌抗原特异性的局部免疫应答中仍然可能存在一定程度上的体液免疫和细胞免疫的应答偏好（bias），也可能表现为体液免疫应答作为细胞免疫应答的补充参与抗M.tb感染的免疫应答。

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绪论

第一章 结核分枝杆菌抗原的表达与纯化

1.1材料

1.1.1 主要试剂

1.1.2 主要仪器

1.1.3 购自BEI resource公司的表达质粒载体

1.2 方法和步骤

1.2.1 表达载体与表达菌株的构建

1.2.2 蛋白诱导表达条件的优化--小规模蛋白诱导表达

1.2.3 大规模蛋白诱导表达与纯化

1.2.4 蛋白印迹验证纯化抗原

1.3 结果

1.3.1 39个抗原的信息总结

1.3.2 原核表达纯化获得39个结核分枝杆菌抗原

1.3.3免疫印迹验证纯化抗原为含His-tag标签的目的蛋白

4. 讨论

第二章 结核分枝杆菌抗原特异性体液免疫应答特征谱分析

2.1 试剂与材料

2.1.1 主要试剂

2.1.2 主要材料和仪器

2.1.3 检测对象及样本

2.2方法和步骤

2.2.1 间接ELISA检测纯化抗原特异性抗体

2.2.2 免疫印迹检测纯化抗原特异性抗体

2.2.3 数据分析

2.2.4 统计学分析

2.3 结果

2.3.1 结核分枝杆菌抗原特异性IgG应答

2.3.2 免疫印迹检测显示抗原特异性IgG应答

2.3.3结核分枝杆菌抗原特异性IgM应答

2.3.4 结核分枝杆菌抗原特异性Ig A 应答

2.3.5 结核分枝杆菌抗原特异性IgG1应答

2.3.6结核分枝杆菌抗原特异性IgG2应答

2.3.7抗原特异性的不同类别抗体之间的关系

2.3.8 不同临床表现的结核患者的IgG应答水平比较

2.3.9 不同临床表现的结核病患者的IgM应答比较

2.3.10 不同临床表现的结核病患者的IgA应答比较

2.3.11不同临床表现的结核病患者的IgG1应答比较

2.3.12 ROC分析特异性抗体作为结核病血清学标志物的可能性

2.3.13 抗Rv0440的IgG抗体在结核病血清学诊断中对抗38KD IgG的补充性

2.4 讨论

第三章 结核分枝杆菌抗原特异性体液免疫应答与细胞免疫应答的关系

3.1 试剂和材料

3.2 方法和步骤

3.2.1 PBMCs的分离

3.2.2 ELISPOT检测PBMCs经抗原刺激后分泌IFN-γ的T细胞频率

3.3 结果

3.3.1 ELISPOT检测结果分析

3.3.2 结核分枝杆菌抗原特异性的T、B细胞应答水平分析与比较

3.3.3 结核病患者抗原特异性的T细胞应答与IgG水平的相关性分析

3.3.4 结核病患者抗原特异性的T细胞应答与IgA水平的相关性分析

3.3.5 结核病患者抗原特异性T细胞应答与IgM水平的相关性分析

3.3.6 结核病患者抗原特异性T细胞应答与IgG1水平的相关性分析

3.4 讨论

结论

参考文献

致谢

硕士期间发表的论文：