大肠埃希菌脂蛋白NlPI参与细胞分裂的机制研究

摘要

细胞分裂是一个多因子参与的复杂过程。研究发现大肠埃希菌(Escherichia coli，E.coli)脂蛋白NlpI突变株可导致子细胞无法分离而产生长丝状体，这表明NlpI参与了细菌的细胞分裂过程。目前发现NlpI与细菌致病性也有密切关系，但NlpI参与细胞分裂的机制还不清楚。为了进一步探讨NlpI在大肠埃希菌细胞分裂中的作用，深入地理解细胞分裂过程，本课题采用分子生物学手段，结合微生物学和生物化学等研究方法主要展开以下三部分的研究:
　　1.我们以E.coli菌株MG1655基因组DNA为模板，构建了pQE80-nlpI重组质粒，并在37℃诱导表达。结果发现细菌生长受到严重抑制，用革兰染色法和扫描电镜检测均显示诱导菌株的细胞形态发生了改变，DAPI染色显示拟核分裂受到抑制。我们进而在菌株MG1655中分别诱导pQE80-nlpI-M(缺少N端信号肽序列)、pQE80-nlpI-282（缺少C端12个氨基酸序列）和从第5个TPR结构域开始C端截短的pQE80-nlpI-233重组质粒，结果显示nlpI-M和nlpI-233的诱导表达均未影响细菌拟核分裂，而编码有功能NlpI的nlpI-282与全长nlpI的诱导表达相似，菌株生长及拟核分裂均受到抑制。以上实验表明NlpI能抑制细菌生长和拟核分裂，参与了细菌分裂过程，而NlpI的N端信号肽和C端功能的完整性在此过程中起重要作用，我们称此过程为NlpI介导的细胞分裂途径。DNA芯片检测显示，诱导表达nlpI后细菌中部分基因的转录水平出现上调或下调。
　　2.为了进一步研究NlpI参与E.coli细胞分裂的作用机制，我们分别收集诱导nlpI表达前后的E.coli，分离胞质、内膜和外膜蛋白，发现蛋白表达谱出现明显差异，经质谱鉴定，胞质中热激蛋白IbpA(包涵体相关蛋白)明显升高，外膜中外膜蛋白OmpW明显降低。qRT-PCR和基因芯片检测证实ibpA mRNA水平明显升高，ompWmRNA水平降低。编码热激蛋白IbpA和IbpB的ibpA和ibpB属于一个操纵子，受到σ32调控。为此我们分别构建了ibpA、ibpB、ibpAB和ompW等基因敲除株及回补菌株△ibpA/pA C-ibpA，观察在这些菌株中诱导表达nlpI后细菌的变化。通过监测细菌生长、观察拟核形态、用qRT-PCR和Western blot等方法检测，结果显示在诱导表达nlpI引起菌生长异常过程中，IbpA和IbpB帮助NlpI引起拟核分裂异常。
　　通过在菌株MG1655中诱导表达nlpI-M、nlpI-282或者nlpI-233，用qRT-PCR和Western blot等方法检测，我们发现nlpI-233的诱导表达并未引起ibpA和ibpBmRNA水平和相应蛋白水平升高，这进一步证明了在NlpI介导的细胞分裂过程中，ibpA和ibpB mRNA水平和相应蛋白水平升高与nlpI的诱导表达有关。根据Westernblot检测结果，我们推测在NlpI到达外膜的同时，IbpA和IbpB也随着到了外膜。此外，在菌株MG1655中诱导IbpA和/或IbpB的大量表达并没有抑制细菌的生长。而通过免疫共沉淀、蛋白纯化和细菌双杂交等实验进一步证实NlpI与IbpB存在直接相互作用。从以上实验中，我们推测NlpI参与细胞分裂的一个作用机制可能是，nlpI的诱导表达导致IbpA和IbpB蛋白量增高，因NlpI与IbpB存在相互作用，而IbpA和IbpB之间也存在相互作用，IbpA和IbpB可随着NlpI到达外膜，与NlpI共同作用引起拟核分裂异常，进而参与了NlpI介导的细胞分裂。IbpA和IbpB作为分子伴侣主要参与蛋白的复性过程。在这项研究中我们首次发现并证实了IbpA和IbpB的另一个重要作用，即参与了NlpI介导的细胞分裂。
　　DNA芯片、qRT-PCR和Western blot等实验表明，nlpI的诱导表达可引起细胞中ompW转录水平降低，OmpW蛋白水平降低，结合扫描电镜结果，我们推测因诱导表达nlpI引起细胞中OmpW减少，以致外膜不完整，进而导致细菌裂解。
　　3.通过荧光显微镜观察细菌内诱导的FtsZ-YFP蛋白和DAPI染色后的拟核形态，我们发现，诱导表达nlpI或nlpI-282均能抑制细菌拟核分裂以及影响FtsZ-YFP蛋白的定位与聚集，而诱导表达nlpI-M或nlpI-233对此没有影响。我们推测nlpI的诱导表达导致拟核变大，分裂异常，进而影响了FtsZ蛋白在细菌中的定位和聚集，这也进一步证明了NlpI与细菌分裂有关。
　　本研究首次深入探讨了NlpI参与细菌分裂的作用机制，并发现IbpA和IbpB参与了NlpI介导的细胞分裂。此外，我们还发现，NlpI通过减少细胞中OmpW，引起外膜不完整进而导致细菌裂解。这些发现将加深我们对细胞分裂这一重要生命过程的理解，并为新的抗生素作用靶点的开发提供理论依据和实验基础。

目录

声明

论文创新点

摘要

符号说明

第一章 大肠埃希菌脂蛋白NlpI参与细胞分裂机制的研究进展

1．1 大肠埃希菌细胞分裂机制

1．2 脂蛋白NlpI与细胞分裂、细菌致病性有关

1．3 研究目的和内容

第二章 大肠埃希菌脂蛋白NlpI参与细菌分裂过程

引言

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

第三章 IbpA和IbpB参与NlpI介导的细菌分裂过程

第一节 IbpA和IbpB在NlpI介导的细菌分裂过程中发挥重要作用

引言

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．1．3 结果

3．1．4 讨论

第二节 NlpI影响IbpA和IbpB的表达与定位

引言

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．2．3 实验结果

3．2．4 讨论

第四章 NlpI影响FtsZ的定位与聚集

引言

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．3 实验结果

4．4 讨论

全文总结

参考文献

致谢

博士期间主要业绩