三种遗传性疾病的基因诊断及分子发病机制研究

摘要

本研究对导致Ⅱ型遗传性抗凝血酶(antithrombin，AT)缺陷症的突变热点ATLeu99进行了突变蛋白的结构与功能研究，以探讨AT Leu99突变导致遗传性AT缺陷症的分子机制。此外，本研究收集了石骨症(Osteopetrosis)和X连锁先天性肾上腺发育不良(X linked adrenal hypoplasia congenita，XL-AHC)等罕见性遗传病家系，并对此开展了临床表现、家系调查、实验室检测和基因诊断（TCIRG1基因、CLCN7基因和NROB1基因）等方面的研究;对所发现的CLCN7基因剪接位点突变c.1798-1G＞T进行了转录研究，以探讨其导致石骨症的分子发病机制。
　　AT是人体抗凝系统的主要因子之一，遗传性AT缺陷症是由编码AT蛋白的基因突变所引起，是静脉血栓栓塞症的主要遗传性危险因素。AT Leu99是导致Ⅱ型AT缺陷症的突变热点，已在多个家系中有报道，本研究构建了多种Leu99突变表达质粒（Leu99Phe、Leu99Val、Leu99Ala、Leu99Ile以及Leu99Ser），在体外探讨Leu99突变导致遗传性AT缺陷症的分子机制。实时荧光RT-PCR显示Leu99突变AT基因和野生型AT(AT WT)基因在转录水平无差异;同位素代谢示踪实验显示，Leu99Phe和Leu99Val突变AT表达受损，分别为AT WT的36.9％和13.8％。采用果蝇S2细胞表达系统对AT WT和Leu99突变AT进行表达和纯化。肝素结合试验显示AT Leu99Val、Leu99Ala、Leu99Ile和Leu99Ser突变AT蛋白与低分子量肝素钠的结合分别为相同浓度AT WT的(44.8±3.6)％、(118.9±14.0)％、(15.2±8.8)％和(23.0±8.2)％。表面等离子共振实验显示AT Leu99Val、Leu99Ala、Leu99Ile和Leu99Ser突变蛋白与凝血酶的结合分别为相同浓度AT WT的13％、57％、3％和29％; AT Leu99Val、Leu99Ala、Leu99Ile和Leu99Ser突变AT蛋白与FXa的结合分别为相同浓度AT WT的7％、51％、1％和25％。发色底物法显示，AT WT及Leu99Val、Leu99Ala、Leu99Ile、Leu99Ser等突变型AT蛋白活性分别为146.5％、21.4％、120.9％、10.8％和39.0％。圆二色性检测显示Leu99突变导致AT蛋白二级结构中α-螺旋减少、β-片层增多，可见Leu99位点不同氨基酸侧链可引起AT空间构象的改变，从而使AT与肝素或凝血酶、FXa等底物的结合受到不同程度的破坏。AT抗原水平的下降以及AT与肝素和底物的结合受损，均导致了AT蛋白抗凝活性的下降，从而导致遗传性AT缺陷症。
　　石骨症是一种罕见的遗传性骨发育障碍性疾病，以破骨细胞异常、骨吸收缺陷及骨硬化为特征，临床表型及基因型十分多样。本研究通过TCIRG1基因和CLCN7基因的检测，在石骨症家系先证者中发现了TCIRG1基因复合杂合突变:c.909C＞A(p.Tyr303X)和c.2008C＞T(p.Arg670X)以及CLCN7基因杂合剪接位点突变:c.1798-1G＞T。通过对先证者外周血白细胞中的CLCN7因转录本的分析，发现CLCN7基因c.1798-1G＞T突变导致了2种发生比例不同的异常CLCN7剪接，其中发生比例较高的是CLCN7因20号外显子缺失，而发生比例较低的是潜在剪接位点的激活，即CLCN7因20号外显子起始处24 bp缺失。TCIRG1基因和CLCN7基因同时突变的石骨症病例目前未见报道;此外，TCIRG1基因c.909C＞A p.Tyr303X突变和CLCN7基因c.1798-1G＞T突变目前亦未见报道。通过本研究，该家系先证者确诊为常染色体隐性遗传石骨症。
　　XL-AHC是一种罕见的遗传性肾上腺皮质发育缺陷性疾病，临床表现轻重不一，NROB1基因突变是导致XL-AHC的致病原因。本研究中XL-AHC家系先证者主要表现为肾上腺皮质功能低下伴/不伴低促性腺激素性腺发育不良，在不同的先证者中共检测到7种不同的NROB1基因突变，即c.871T＞G(p.Trp291Gly)、c.376G＞A(p.Val126Met)、 c.195_207delinsTG(p.Cys66GlyfsX2)、 c.833T＞C(p.Leu278Pro)、c.543delA(p.Gly183ValfsX80)、c.1102delT(p.Cys368AlafsX3)以及c.501delA(p.Gly169AlafsX94)，其中c.871T＞G、c.195_207delinsTG以及c.1102delT等3种突变目前未见报道。XL-AHC患者临床表型程度和NROB1基因突变之间没有显著关系。NROB1基因检测有助于XL-AHC的确诊。

目录

声明

摘要

第一部分 抗凝血酶Leu99位点突变导致遗传性抗凝血酶缺陷症的分子发病机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 石骨症新致病基因突变的发现及其致病机制的探讨

前言

材料与方法

结果

讨论

第三部分 X连锁先天性肾上腺发育不良患者表型及基因型诊断的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 罕见性遗传病的分子诊断

致谢

攻读学位期间以第一作者发表的学术论文