DNA磷硫酰化修饰的基因组分布及其生理生化研究

摘要

DNA磷硫酰化修饰是目前唯一被发现的DNA骨架上的天然修饰，即硫原子取代 DNA骨架磷原子上的非桥联氧原子形成磷硫酰化修饰。它突破了 DNA由碳、氢、氧、氮、磷五种元素构成的结论，拓展了经典的 DNA组成理论，引起了国内外广泛关注。尽管对这种新型表观遗传学修饰的相关基因组成、化学结构鉴定、修饰序列特异性以及限制外源基因自我保护等研究方面取得了一定的进展，但仍然有以下一些科学问题尚未解析：（1）质谱技术检测发现磷硫酰化修饰以不同修饰频率广泛存在于原核生物基因组上不同的二核苷酸之间。然而，修饰所需的保守序列及在基因组上的分布情况仍然是该领域尚未解析的重要科学问题。（2）磷硫酰化修饰是由5个基因组成的基因簇（dndA-E基因簇家族）负责的，但是修饰发生的酶学机理尚未阐明。（3）生理功能方面，磷硫酰化修饰被证实参与了一种新型限制修饰系统，该系统限制不含磷硫酰化修饰的质粒 DNA转化进入其宿主菌，而这一限制系统的作用机理及其酶学特性尚未得到研究。
　　为了进一步理解 DNA磷硫酰化修饰这一新型表观修饰现象，解析以上科学问题，本论文致力于以下三个方面的研究：
　　一、DNA磷硫酰化修饰基因组分布图谱的解析。本研究建立了两种基于不同原理的方法，用于鉴定基因组上的磷硫酰化修饰位点：单分子实时DNA测序技术（Single-Molecule Real-Time DNA sequencing,简称 SMRT）和碘切割依赖的 DNA深度测序技术（Iodine-cleavage based deep DNA sequencing，简称 ICDS）。利用这两种技术，以大肠杆菌（Escherichia coli B7A）为模式菌株，获得了首个细菌 DNA磷硫酰化组图谱。其中，SMRT技术可以实现在 DNA测序过程中对修饰位点进行直接检测，发现在B7A约5.2 Mb基因组上，共含有4855个磷硫酰化修饰位点，这些修饰位点共有的保守序列为4 bp的 GpsAAC/GpsTTC motif。然而，基因组上只有约12％（4855/40,701）的GAAC/GTTC位点发生了修饰。SMRT单分子分析发现,磷硫酰化修饰具有部分修饰（partial modification）的特征，即这些修饰位点在不同的 DNA分子上并非一直被修饰，而且不同修饰位点具有不同的修饰频率。ICDS技术则是基于磷硫酰化修饰位点可以被碘特异性切割的化学特性，实现了对修饰位点的间接定位。ICDS技术鉴定了 B7A基因组上7000多个磷硫酰化修饰位点，这些位点90%以上与 SMRT技术检测到的位点相一致，而且该技术较 SMRT技术检测到了更多处于低修饰频率的位点。对B7A基因组磷硫酰化修饰图谱进行分析，发现除了核心保守序列以外，修饰对侧翼序列以及基因组功能区域均具有一定的偏好性，这对进一步研究其生理学功能和酶学催化机理提供了指导和理论依据。
　　二、磷硫酰化修饰依赖的限制系统的作用机制。首次发现该限制系统具有与经典的甲基化依赖的限制系统具有多方面不同的作用特征：在磷硫酰化修饰缺失的情况下，限制系统的存在对修饰突变株宿主不具有致死效应，而是造成了宿主明显的病理表型，如生长迟缓，细胞膜损伤，细胞分裂障碍等。基因组转录谱分析发现，限制系统的单独存在影响了修饰缺失宿主多达600余个基因的表达，而且这些基因的功能与宿主菌表型的改变相吻合。通过 TUNEL实验，获得了限制系统对修饰缺失宿主的基因组 DNA造成断裂损伤的直接实验证据。限制酶体外分析具有ATP水解酶活性，说明该限制系统是 ATP依赖的、对不含磷硫酰化修饰的DNA通过某种方式造成断裂损伤的作用机理。
　　三、DNA磷硫酰化修饰蛋白的酶学特征及作用机理。细菌基因组上磷硫酰化修饰具有部分修饰现象，说明修饰酶具有特殊的底物选择性。通过建立一种细胞裂解液体外催化 DNA磷硫酰化修饰的反应系统，发现体外 DNA磷硫酰化修饰具有比细胞内更广泛的底物选择性，即胞内未被修饰位点可以在细胞裂解液中发生修饰，而且修饰位点的侧翼序列对修饰发生没有影响。此外，一条链修饰的 DNA可以被催化成为双链修饰，而对单链 DNA则不具有催化活性。体外酶学实验证实，沙门氏菌的磷硫酰化修饰蛋白 DptCDE以蛋白复合体的形式行使功能，且蛋白复合体中的3个蛋白亚基都是以四聚体的形式存在。该蛋白复合体具有非序列特异性的DNA结合活性。
　　DNA磷硫酰化修饰是表观遗传学领域近年发现的一种新型生理修饰，本论文的相关工作推动了这种新型表观遗传学修饰研究的向前发展：(1)细菌基因组DNA磷硫酰化修饰分布图谱的解析，加深了对DNA磷硫酰化修饰这一新兴研究领域的理解，为进一步研究其生理功能提供了理论参考和指导，对理解这一特殊表观遗传学修饰的生物化学过程也提供了重要依据。(2) DNA磷硫酰化修饰依赖的限制系统的作用机制研究的系列发现，揭示了它是完全不同于传统限制修饰系统的一种新型限制修饰系统，加深了人们对自然界中基因组防御系统多样性的认识。(3)DNA磷硫酰化修饰酶催化体系的构建以及催化复合体相关酶学研究，加深了人们对这一特殊生物催化途径的理解，为利用酶催化方法制备序列特异性和构型专一性的磷硫酰化修饰DNA奠定了基础。

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第一章绪论

1.1 DNA表观遗传修饰—碱基修饰

1.2 DNA新型表观遗传修饰—骨架磷硫酰化修饰的发现历程

1.3 DNA磷硫酰化修饰研究近期进展

1.4本研究的内容和目的

第二章 实验材料和方法

2.1实验材料

2.2实验方法

第三章DNA磷硫酰化修饰基因组分布图谱的鉴定

前言

3.1 定位DNA磷硫酰化修饰位点的策略及原理

3.2 SMRT测序技术定位基因组磷硫酰化修饰位点

3.3碘切割依赖的深度测序技术定位基因组上磷硫酰化修饰位点

3.4 DNA磷硫酰化位点存在高度部分修饰

3.5高度部分修饰和限制系统共存

本章小结

第四章DNA磷硫酰化修饰依赖的限制系统作用机理研究

前言

4.1限制酶的酶学性质分析

4.2限制系统对修饰基因突变株的表型影响

4.3 限制系统损伤宿主细胞膜的完整性

4.4限制系统对修饰基因缺失突变株基因组转录谱的影响

4.5限制系统对修饰基因缺失突变株基因组DNA造成断裂损伤

4.6 DNA磷硫酰化修饰依赖的限制系统特性总结

本章小结

第五章DNA磷硫酰化修饰酶催化机理探索

前言

5.1 DNA磷硫酰化修饰体外催化系统的建立

5.2 DNA磷硫酰化修饰的底物特异性研究

5.3 DNA磷硫酰化修饰酶复合体的鉴定

5.4 DNA磷硫酰化修饰酶复合体的底物结合特异性研究

本章小结

第六章本研究的工作总结及展望

6.1工作总结

第2节本研究工作的创新点

第3节本研究工作的进一步展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表学术论文及科研成果

答辩决议书