尿肌氨酸LC-MS检测方法的建立及其在前列腺癌中的诊断应用与机制研究

摘要

【目的】
　　建立同位素稀释的液相色谱串联质谱方法测定肌酐校正后尿肌氨酸的含量，对该方法进行完整的方法学评估。应用该方法对前列腺癌、健康和疾病对照尿液样本中肌氨酸含量进行检测，并评价尿肌氨酸在前列腺癌诊断中的应用。以miRNA为切入点，研究与肌氨酸代谢密切相关基因GNMT和DMGDH在前列腺癌中的表达情况，初步探讨其在肌氨酸代谢中的可能机制。
　　【方法】
　　（1）方法建立及评估。收集2014年5月至2014年10月入院的前列腺癌（PCa）患者36例，良性前列腺增生（BPH）患者15例和我院健康体检患者122例，随机尿5 mL。以稳定同位素标记[2H3]-肌氨酸作为内标，首先使用丹磺酰氯对肌氨酸进行柱前衍生，应用ID-LC-MS技术同时测定尿肌氨酸和肌酐含量。同时评价该方法的线性、最低检出限、精密度和回收率，并与酶法比较一致性。
　　（2）尿肌氨酸的临床应用。比较前列腺癌患者、良性前列腺增生患者及健康人群的尿肌氨酸/肌酐水平，并通过ROC曲线评价尿肌氨酸对前列腺癌诊断及良性前列腺增生鉴别诊断的效果；比较不同病理分级和分期的前列腺癌患者的尿肌氨酸/肌酐水平；研究尿肌氨酸与PSA比值联合诊断的意义；初步确定正常人尿肌氨酸的参考范围。
　　（3）通过realtime PCR检测参与肌氨酸代谢基因GNMT和DMGDH及其潜在相关miRNA在人前列腺癌细胞株LNCaP、DU-145、PC-3和人正常前列腺上皮细胞RWPE-1中的表达水平，并以ID-LC-MS法测定培养上清中的肌氨酸浓度。
　　【结果】
　　（1）用ID-LC-MS法在本实验条件下检测尿肌氨酸特异性高，与同分异构体完全分离亦未见明显干扰因素。尿肌氨酸线性方程为Y=2.0456X+0.0689，R2=0.995；检测限（LOD）为8 ng/mL，定量限（LOQ）为25 ng/mL；批内和批间变异系数（CV）均<6％；回收率范围96.8%~105.1%；ID-LC-MS法与酶法结果具有相关性，R2=0.815，P<0.01，平均偏差为-37.1%。
　　（2）PCa组尿肌氨酸/肌酐水平显著高于健康人群（P<0.001）和BPH组（P<0.05）；尿肌氨酸/肌酐水平在健康人群组与BPH组中无明显差异；分析非PCa组（健康人和BPH）与PCa组的尿肌氨酸/肌酐ROC曲线，其截断值为0.286 mg/g，灵敏度为75%，特异性为90.79%，曲线下面积为0.871；分析各指标鉴别诊断BPH和PCa的ROC曲线，得出PSA比值和尿肌氨酸/肌酐的两指标AUC值分别为0.700和0.752。
　　（3）相较于其他前列腺癌细胞株和正常前列腺上皮细胞，LNCaP细胞中GNMT的基因表达显著升高，该细胞培养上清的肌氨酸水平也显著升高；miR-15a及miR-146b在PCa细胞系中表达均有不同程度下降。
　　【结论】
　　（1）成功建立ID-LC-MS测定尿液肌氨酸方法，该方法具有良好的特异性、灵敏度和可重复性，能够作为前列腺癌诊断的可靠技术平台。
　　（2）应用上述方法，结果显示PCa患者的尿肌氨酸/肌酐水平显著高于BPH患者和正常人。ROC曲线分析表明，无论是诊断PCa，还是鉴别诊断BPH，尿肌氨酸/肌酐对于PCa均有较好的诊断能力，尤其对鉴别诊断BPH的能力优于传统的PSA比值。
　　（3）LNCaP细胞培养上清中肌氨酸水平的增加与GNMT的表达有关，参与GNMT表达调控的miRNA分子有望成为重要的PCa预测、诊断和预后的生物标志及治疗靶点。

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主要缩略词对照表

绪论

第一部分ID-LC-MS法定量检测尿肌氨酸的方法建立及评估

材料与方法

结果

讨论

第二部分尿肌氨酸在前列腺癌诊断中的应用

材料与方法

结果

讨论

第三部分GNMT、DMGDH基因及其相关miRNA在前列腺癌细胞株中的表达情况

材料与方法

结果

讨论

全文结论

参考文献

附录

前列腺腺癌的Gleason组织学分级

前列腺腺癌的TNM分期

致谢

攻读学位期间发表的论文