白藜芦醇对脂多糖诱导H9c2细胞损伤的保护作用及其机制

摘要

目的：研究脂多糖(lipopolysaccharide，LPS）诱导的H9c2细胞损伤的信号通路及白藜芦醇（resveratrol，RSV）对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的H9c2细胞损伤的影响及相关机制。
　　方法:1.将H9c2细胞随机分为实验组（Con），白藜芦醇5μM组（R5），白藜芦醇10μM组（R10），白藜芦醇20μM组（R20），白藜芦醇50μM组（R50）。其中Con组不做任何处理，R5组、R10组、R20组、R50组分别用5μM、10μM、20μM、50μM的白藜芦醇处理24h，MTT法检测H9c2细胞增殖能力。2.将H9c2细胞分为对照组（Con），脂多糖组（LPS）,脂多糖+白藜芦醇5μM组（L+R5），脂多糖+白藜芦醇10μM组(L+R10)，脂多糖+白藜芦醇20μM组(L+R20)，脂多糖+白藜芦醇50μM组(L+R50)。其中Con组不做任何处理，L+R5组、L+R10组、L+R20组、L+R50组分别用5μM、10μM、20μM、50μM的白藜芦醇预先处理24h，然后将LPS组、L+R5组、L+R10组、L+R20组、L+R50组和10μg/ml的脂多糖共同培养12h。MTT法检测H9c2细胞增殖能力。3.将六孔板培养的H9c2心肌细胞放置在37℃5% CO2培养箱中孵育24h后，用LPS10μg/ml处理0 min,5min，10min，20min，30min，60min后，评估 LPS在不同时间点对 H9c2细胞表达 p-P38，P38 p-JNK1/2,JNK1/2,p-ERK1/2，ERK1/2，IκBα，p-p65，p65，β-actin的影响。4.将H9c2细胞分为对照组（Con），脂多糖组（LPS），脂多糖+白藜芦醇5μM组（L+R5），脂多糖+白藜芦醇10μM组(L+R10)，脂多糖+白藜芦醇20μM组(L+R20)，脂多糖+白藜芦醇50μM组(L+R50)。其中Con组不做任何处理，L+R5组、L+R10组、L+R20组、L+R50组分别用5μM、10μM、20μM、50μM的白藜芦醇预先处理24h，然后将LPS组、 L+R5组、L+R10组、L+R20组、L+R50组和10μg/ml的脂多糖共同培养20min。Western blot检测p-P38，P38，p-JNK1/2,JNK1/2,p-ERK1/2，ERK1/2，IκBα，p-p65，p65，β-actin的表达水平。5、将H9c2细胞随机分为Con组、LPS组、RSV 组、L+R5组；其中RSV组、L+R5组用5μM RSV预先处理24 h，再将 LPS组和 L+R5组用10μg/mL的LPS共同处理12 h。免疫荧光法检测H9c2心肌细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平。流式细胞术检测H9c2心肌细胞凋亡。ELISA法检测细胞质中TNF-α的表达。
　　结果：
　　1）低浓度的白藜芦醇对H9c2细胞的影响不大，但是较高浓度（50μM）的白藜芦醇对H9c2细胞增殖有明显抑制作用（P＜0.05）。
　　2）与对照组相比，LPS刺激12h能对H9c2细胞增殖产生明显抑制作用，5μM的白藜芦醇预先处理24h能显著减弱LPS对H9c2细胞增殖的抑制作用（P＜0.05）。
　　3）将H9c2心肌细胞用脂多糖处理不同时间后，发现脂多糖刺激5min后，p-P38，p-JNK1/2，p-ERK1/2，p-p65开始升高，同时IκBα表达水平开始下调。在刺激20min时，P38，JNK1/2，ERK1/2，p65磷酸化上升水平达到最高峰（P＜0.01）且IκBα下降水平同时达到最低（P＜0.01），处理30min后p-P38，p-JNK1/2，p-ERK1/2，p-p65表达水平开始下降，IκBα表达水平开始上升。
　　4）用不同浓度RSV处理H9c2心肌细胞24 h后，再用LPS处理20min，5μM RSV能够显著下调p-P38，p-JNK1/2，p-ERK1/2，p-p65表达（P＜0.01）；并上调IκBα表达（P＜0.01），但是50μM RSV显著上调p-P38，p-JNK1/2，p-ERK1/2，p-p65表达（P＜0.01），并下调IκBα表达（P＜0.01）。
　　5）与Con组相比，LPS组H9c2细胞内ROS的产生量明显增加（P＜0.01）；而用5μM浓度的RSV预处理后能显著降低 LPS诱导的细胞内ROS的产生量（P＜0.01）。
　　6）细胞流式术检测不同组细胞凋亡的情况发现，脂多糖处理的H9c2心肌细胞凋亡数量明显增加（P＜0.05），而用5μM浓度的RSV预处理后能显著降低 LPS诱导的H9c2心肌细胞凋亡（P＜0.01）。
　　7）与Con组相比，LPS明显诱导TNF-α上调（P＜0.05），而用5μM浓度的RSV 预处理后，TNF-α的表达显著下降（P＜0.05）。
　　结论:1）脂多糖通过上调p-P38，p-JNK1/2，p-ERK1/2，p-p65的表达，下调IκBα的表达诱导H9c2细胞损伤。2）白藜芦醇通过下调p-P38，p-JNK1/2，p-ERK1/2，p-p65的表达，上调IκBα的表达来抑制脂多糖诱导H9c2细胞损伤，从而发挥保护细胞作用。

目录

中英文对照

绪论

引言

材料和方法

1. 主要实验仪器

2. 主要实验试剂

3. 主要溶液的配置

4. 细胞培养

5. 实验步骤

6.实验方法

7. 处理分析数据

结果

讨论

一、白藜芦醇在MAPKs和NF-κB信号通路中的研究进展

二、白藜芦醇减轻脂多糖对H9c2 细胞增殖的抑制作用

三、白藜芦醇抑制脂多糖诱导细胞损伤的作用机制

四、MAPKs 信号通路和 NF-κB 信号通路在调控细胞凋亡中的联系。

五、局限性

结论

参考文献

致谢

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