鲮鱼微卫星标记的开发与应用以及抗菌肽LEAP-2基因真核表达载体的构建

摘要

第一部分为“鲮鱼微卫星分子标记的开发与应用”。微卫星标记是一种以2～6bp的核苷酸序列，成串联重复散布于真核生物基因组中的重复序列，一般重复数为4～60次，具有保守性、共显性遗传和多态性程度高等遗传特点。目前这一标记已广泛应用于水产养殖品种的遗传研究和种质鉴定。本研究从鲮鱼基因组中开发出此标记，并将其应用于鲮鱼养殖群体和野生群体的遗传多样性研究。首先通过磁珠富集法构建鲮鱼微卫星富集文库，采用的生物素探针为(CA)15°所建文库共约2000个克隆，随机选取900个，通过同位素杂交进行二次筛选，得到阳性克隆252个(阳性克隆率约为28％)，送出测序60个，得到56个(93.3％)含有微卫星序列的克隆。其中，完美型微卫星49个(87.5％)，非完美型微卫星2个(3.6％)，复合完美型微卫星5个(8.9％)；95.56％的微卫星序列与探针序列CA(GT)重复单元相符，此外还观察到CT(AG)的重复序列；53.6％的微卫星DNA其核心序列的重复长度为10～60bp。在这56个微卫星序列中,45个含有合适片断长度的侧翼序列，适合设计引物。利用引物设计软件Primer Premier5.00和Primer 3.0，共设计引物39对。通过PCR扩增进行筛选，结果有18对能扩增出清晰的条带，其中12对具有多态性。用这12对引物对鲮鱼野生(30尾)和养殖(20尾)两个群体进行遗传多样性分析，结果显示：在12个位点共有109个等位基因，平均每个位点9.08个；野生群体12个位点期望杂合度变动范围为0.2815～0.9356，养殖群体12个位点期望杂合度变动范围为0.2615～0.9500;野生群体和养殖群体的平均表观杂合度分别为0.6361和0.6417；以上数据均说明养殖群体的遗传多样性相比野生群体并没有下降。UPGMA树、GST值和遗传距离是检测群体之间遗传分化程度的几个非常重要的指标：鲮鱼UPGMA系统树结果显示了两个群体之间并没有明显的聚类；养殖群体和野生群体之间的遗传距离为0.1546，遗传相似性为0.8568；两者之间的Gst为0.0473。综合上述三个指标，我们认为鲮鱼养殖群体和野生群体之间遗传分化程度不高。虽然如此，依然要密切关注鲮鱼种群在遗传水平上的变化发展，使鲮鱼的优良种群资源得到持续。本实验获得的微卫星标记多态性较高，可用于鲮鱼其他群体的遗传多样性和群体遗传结构研究，并为与鲮鱼经济性状相关基因的连锁定位及其品种优化打下基础。 第二部分为“皮肤特异启动子驱动的抗菌肽LEAP-2基因真核表达载体的构建”。抗菌肽(AMPs)是一种小分子肽，是生物体内天然免疫系统的重要元素，在机体抵抗病原的入侵方面起着重要的作用，更被认为是缺乏特异性免疫功能生物的重要防御成分。随着分子遗传学的迅速发展，转基因技术已成为鱼类育种的重要手段之一。于是希望通过转基因技术将抗菌肽基因转入虹鳟鱼，使其抗菌能力增强。本实验构建了皮肤特异启动子驱动的抗菌肽LEAP-2基因真核表达载体，为抗菌肽转基因虹鳟鱼的构建打下基础。首先用限制性内切酶Age Ⅰ和Not Ⅰ，双酶切含有斑点叉尾鮰LEAP-2(肝脏表达抗菌肽)基因的pSPORT 1重组质粒，同样的酶双酶切含有斑马鱼Ⅱ型细胞角蛋白基因(CK)启动子的pCK-EGFP1真核表达载体，得到的LEAP-2基因片段和含有皮肤特异启动子的表达载体pCK-E通过T4 DNA连接酶进行定向连接。连接产物转化入大肠杆菌DH5a，然后从DH5a中分离纯化重组表达质粒pCK-LEAP-2。分别用双酶切和PCR方法鉴定重组表达质粒：pCK-LEAP-2经Age Ⅰ和Not Ⅰ双酶切后产生出大小约0.9kb和5.7kb的两个片段；经PCR扩增产生出大小约500bp的目的片段。两项检测结果均表明已成功构建出皮肤特异启动子驱动的抗菌肽LEAP-2基因真核表达载体。未来，将把所构建的抗菌肽基因表达载体转入虹鳟鱼基因组内，并构建稳定遗传的转基因虹鳟家系，对虹鳟养殖病害的防治起着举足轻重的作用。如今，水产养殖业提倡的健康养殖理念已深入人心，联系到前几年我国出口的水产品因为药物残留超标多次遭到欧美制裁，造成巨大的经济损失和不良的国际影响，转基因抗病品种的培育就越显得紧迫和具有现实意义。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章引言

1.1鲮鱼生物学特征与地理分布

1.1.1生物学特征与分布

1.1.2经济价值

1.2微卫星分子标记技术及其在水产遗传育种方面的应用

1.2.1微卫星的定义与发展简史

1.2.2微卫星的分类

1.2.3微卫星的分布

1.2.4微卫星标记的特点

1.2.5微卫星分子标记技术的基本原理与主要步骤

1.2.6微卫星分子标记技术在水产动物遗传育种研究中的应用

1.2.7本实验研究目的和意义

1.3抗菌肽简介

1.4转基因技术及其在鱼类育种中的应用

1.4.1外源基因的结构及克隆

1.4.2转基因鱼技术

1.4.3转基因检测方法

1.4.4转基因鱼研究现状

1.4.5本实验研究目的和意义

第二章鲮鱼微卫星分子标记的开发与应用

2.1材料与方法

2.1.1实验动物

2.1.2实验仪器与试剂

2.1.3生物软件

2.1.4鲮鱼微卫星富集文库的建立

2.1.5微卫星序列引物设计与筛选

2.1.6鲮鱼养殖群体和野生群体的遗传多样性研究

2.1.7数据分析

2.2实验结果

2.2.1基因组DNA提取

2.2.2适宜大小的基因组片段的筛选

2.2.3菌落PCR检测重组率

2.2.4测序结果

2.2.5引物设计与筛选

2.2.6微卫星标记对鲮鱼两个群体的遗传多态性分析

2.2.7哈特温伯格平衡

2.2.8鲮鱼养殖群体和野生群体的遗传分化

2.3讨论

2.3.1磁珠富集法结合同位素杂交筛选构建鲮鱼微卫星富集文库的优势

2.3.2鲮鱼微卫星基因组的特征与分布

2.3.3鲮鱼群体的遗传多样性分析

2.3.4哈特温伯格平衡

2.3.5鲮鱼养殖群体和野生群体的遗传分化

第三章皮肤特异启动子驱动的抗菌肽LEAP-2基因真核表达载体的构建

3.1材料与方法

3.1.1实验材料

3.1.2实验仪器与试剂

3.1.3 pCK-LEAP-2真核表达载体的构建

3.1.4两种方法鉴定重组质粒

3.2实验结果

3.2.1原质粒的制备纯化

3.2.2质粒双酶切结果

3.2.3融合表达载体的检测

3.3讨论

第四章结论

参考文献

附录：攻读硕士学位期间发表的论文

致谢