磁性纳米材料的制备及固定化海洋脂肪酶ADM47601的研究

摘要

脂肪酶(甘油酯水解酶,Lipase EC3.1.1.3)是一种重要的生物催化剂,能催化多种反应,被广泛应用于食品、化工及制药工业等。然而,游离脂肪酶的催化技术虽然成熟,但存在不可重复使用、难以实现过程连续化等问题。
　　磁性纳米粒子是20世纪70年代后逐步产生并发展起来的一种具有广阔应用前景的新型功能材料,具有超顺磁性,高饱和磁化强度,各向异性,高分散性和生物相容性等性能,被广泛地应用于生物技术各个领域,如药物靶向及药物运输、磁流体、造影剂、免疫检测、细胞分离、生物传感器、蛋白质和核酸的分离纯化以及癌症诊断等。磁性纳米材料应用于酶的固定化研究可实现酶重复使用、过程连续化,而且可以实现酶与底物有效分离。因此,磁性纳米粒子固定化酶具有广泛的应用前景。
　　本学位论文制备了氨基纳米微球,开展了磁性纳米粒子固定化海洋脂肪酶ADM47601的研究。为开发新型磁性纳米粒子材料和海洋脂肪酶ADM47601的应用奠定了基础,主要内容包括:
　　1.采用化学共沉淀法合成磁性 Fe3O4纳米粒子(Magnetic Nanoparticles, MNP),经过一系列表征,结果表明:所制得的磁性Fe3O4纳米粒子,粒径为7.6 nm,具有超顺磁性,饱和磁化强度为47.87 emu/g。
　　2.以磁性Fe3O4纳米粒子为核,将3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)作为偶联剂选择不同的方法对其进行硅烷偶联化反应:(1)选择正硅酸乙酯(TEOS)与磁性Fe3O4纳米粒子反应,使其表面被硅壳包覆,然后选择硅烷偶联剂3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)与硅壳包覆的磁性纳米微球反应,最终得到氨基修饰的磁性纳米微球;(2)直接选用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)与磁性Fe3O4纳米粒子反应,得到氨基修饰的磁性纳米粒子。通过透射电镜(TEM)、傅立叶变换红外光谱仪(FTIR)、X-射线衍射(XRD)、超导量子干涉仪(SQUID)和热重分析仪(TGA)对合成材料进行表征,从而对两种修饰方法进行比较。结果表明:两种氨基包覆纳米微球的平均粒径皆为8 nm左右,具有良好的晶体结构、具有超顺磁性;磁性 Fe3O4@SiO2-NH2纳米微球及 Fe3O4@NH2纳米微球粒径的饱和磁化强度和氨基含量分别为:19.5 emu/g和36.3 emu/g,20％和3%。与Fe3O4@NH2纳米微球相比,磁性Fe3O4@SiO2-NH2纳米微球粒径均一性良好,更多的氨基含量,故选择磁性Fe3O4@SiO2-NH2纳米微球用于后期的脂肪酶固定化研究。
　　3.应用制备的Fe3O4@SiO2-NH2纳米微球作为固定化酶载体材料,进行了海洋脂肪酶 ADM47601固定化条件研究,实验结果表明,磁性 Fe3O4@SiO2-NH2纳米微球固定化海洋脂肪酶 ADM47601的最佳固定化条件为:酶蛋白浓度为0.125 mg/ml,固定化温度为30℃,固定化体系的pH值为8.0,固定化时间为10 h,酶活力回收率可达到87.7%,单位面积载体的蛋白吸附率可达到23.7 mg/g。
　　4.以最佳固定化条件制备的固定化脂肪酶为样品,以对硝基苯基月桂酸酯作为底物,对固定化脂肪酶的酶促反应条件进行了考察,结果表明,固定化脂肪酶的最佳催化温度为40℃,最佳催化pH为8.0;固定化酶在pH8.0缓冲液中,60℃保温1 h仍能保持42%的活力,游离酶仅为10%;固定化酶和游离酶在pH9.0缓冲液中活力最稳定,30℃保温24 h,固定化酶剩余酶活力94%,游离酶剩余酶活力56%;固定化酶在pH9.0缓冲液中,25℃放置30天,仍然保持81%的活力,游离酶为59%;固定化酶在pH9.0缓冲液中,25℃下贮藏半衰期为99天,游离酶为39天;固定化酶连续操作八次仍然能够保持44%的活性,其操作半衰期为七次;通过米氏方程测定固定化脂肪酶和游离脂肪酶的米氏常数分别为0.79 mg/ml和0.23 mg/ml。

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引言

第一章 文献综述

1 磁性纳米粒子的概述

2. 脂肪酶固定化研究概述

3 磁性纳米粒子固定化酶的研究概述

第二章 磁性四氧化三铁纳米粒子的制备与分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 氨基硅烷修饰磁性Fe3O4纳米粒子的制备及分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四章 磁性纳米颗粒固定化海洋脂肪酶ADM47601的研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第五章 固定化海洋脂肪酶ADM47601的酶学性质的研究

1. 材料与方法

2. 结果与分析

3. 讨论

结论

参考文献

附录

致谢