基于DNA条形码的鱼片(肉)真伪鉴别技术研究

摘要

目前,我国还没有建立权威的鱼肉制品真伪鉴别技术标准,水产加工与流通质量保证体系尚不完善,掺杂使假和食品标签错误标识引发的食品质量与安全问题时有发生。市场中存在以低值鱼冒充高值鱼,甚至使用有毒鱼作生产原料,也存在鱼肉制品中无鱼肉成分的现象。对此,本研究借鉴分子生物学和生物信息学研究成果,选择性地运用DNA条形码技术、PCR-RFLP和荧光定量PCR鉴别技术,建立常见鱼肉制品(鱼片)成分鉴别技术体系及黄渤海地区常见鱼类的DNA条形码数据库,适用于不同实验条件下鱼及其制品的真伪鉴别,以期为鱼肉制品加工流通中的鱼肉成分的质量保证提供技术支持。其主要的研究成果如下:
　　1.DNA条形码鉴别技术的优化
　　对影响DNA条形码技术的关键步骤进行优化,如DNA提取、通用引物筛选、PCR扩增、PCR产物纯化、DNA测序以及序列分析等。结果显示:采用高盐法提取DNA的效果较好、试剂盒法次之、CTAB法最差;使用正己烷有机试剂对含油量较多的样品进行前处理,可以提高鱼肉制品 DNA的提取率;引物对 F1/R1或F1/R2或F2/R2可扩增绝大多数鱼类的COI基因,引物对HCF1/HCR1可以扩增牡蛎、猪、鸡、鸭、牛、兔等肉类的COI基因;PCR反应条件的优化结果显示:DNA条形码技术鉴别鱼肉的DNA检出限为100ng;当DNA模板添加量为150ng,聚合酶加入量为1U,引物加入量为0.6μL,退火温度为54℃时,PCR产物的电泳条非特异性扩增条带较少;PCR成功但测序失败的样品,可以通过构建PMD-18T载体提高测序的成功率。研究表明,DNA测序条形码技术适合加工条件温和、动物源成分单一样品的鉴别,但不适合混合鱼肉制品的鉴别。
　　2.DNA条形码技术在鱼片(肉)鉴别中的应用
　　从青岛不同的超市采集冷冻鱼、鳕鱼片、三文鱼片、烤鱼片等,共计215个样品。其中,冷冻鱼94个,鳕鱼片27个,三文鱼片33个,烤鱼片25个,其它36个。利用DNA条形码技术对其进行鉴定,结果显示:DNA条形码技术可以鉴定绝大多数的鱼类。30种冷冻鱼鉴定的结果与形态学鉴定的结果一致,存在将“少鳞鱚”标识为“沙丁鱼”的现象;27个冻鳕鱼片样品均为鳕鱼,但是50％的鳕鱼片(银鳕鱼除外)是由价格低廉的狭鳕加工而成,存在将“白鳕鱼”标识为“银鳕鱼”的现象;33个三文鱼样品的食品标签均正确,不存在以虹鳟鱼冒充大西洋鲑的现象;25个烤鱼片样品中,68%的烤鱼片标识错误,一些烤鱼片还检出有毒鱼类,如月尾兔头鲀、黑腮兔头鲀等;鱼丸(含单一肉类成分)的肉类成分来源为猪肉或鲢鱼,研究结果表明,DNA条形码技术不能鉴别鱼丸中多种肉类成分来源;最后,从两方面着手建立常见鱼类 DNA数据库,一是将测得的193个鱼类DNA条形码在Excel2010表格中进行分类汇聚,标明样品的详细信息、DNA提取方法、PCR扩增引物、PCR扩增条件、PCR产物纯化、测序方法以及DNA序列整理等;二是利用BOLD网站的数据收集模块,建立了项目名称为“Fish species of China”的鱼类DNA条形码数据库。
　　3.基于DNA条形码的三文鱼快速鉴别方法建立
　　在DNA条形码研究的基础上,以COI基因为靶点,设计的两对鲑科鱼类的通用引物,目的片段大小分别为595bp和844bp,通用性较好。采用RFLP技术对5种三文鱼的PCR产物(844bp)进行酶切分析,建立了三文鱼的PCR-RFLP鉴别技术。结果显示,使用限制性内切酶Msc I和Hind III能够准确、快速地鉴别挪威三文鱼;联合使用限制性内切酶Msc I、Sal1I、Dra I和Ade I(或者限制性内切酶Msc I、Sal1I、Dra I和Van91I)能够将5种三文鱼鉴别到种的水平。
　　为了能够快速地鉴定大西洋鲑和虹鳟鱼,建立了基于SYBR-Green实时荧光定量 PCR快速鉴别大西洋鲑的方法。结果显示,当鲑科鱼类初始模板加入量约为100ng,两对通用引物的浓度比值为1:1、退火温度为50℃时,大西洋鲑和虹鳟鱼的Tm值分别为86.29±0.172℃、83.50±0.201℃,且3个检验批次的Tm值没有显著性的差异(p=0.772),表明大西洋鲑和虹鳟能够通过实时荧光定量PCR熔解曲线法进行准确鉴别。进一步研究发现,该方法也能用于大西洋鲑与红鲑、银鲑以及大马哈鱼的鉴别,具有快速、操作方便、准确度高和重复性好的特点。

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引言

第一章 文献综述

1.1鱼肉概述

1.2 鱼肉真伪鉴别方法

1.3本论文的研究意义

第二章 DNA条形码技术的优化

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4讨论

第三章DNA条形码技术在鱼片（肉）鉴别中的应用

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4讨论

第四章 基于DNA条形码的三文鱼快速鉴别方法的建立

4.1 PCR-RFLP快速鉴别三文鱼方法建立

4.2 荧光实时定量PCR熔解曲线快速鉴别三文鱼方法的建立

第五章 结 论

参考文献

附录

致谢