基于DNA条形码的浆果及其制品真伪鉴别技术研究

摘要

作为一种高附加值水果，浆果在日常生活中越来越受消费者欢迎。然而，由于较短的收获期和较高的价格，浆果及其制品掺假、造假、错误标签等导致的食品质量和安全争议不断发生。目前，我国对浆果及其制品的真伪识别还处于起步阶段。对此，本文通过研究新兴的DNA条形码，建立基于Sanger测序技术的DNA条形码方法，并应用于市售浆果制品的检测，检测范围涉及完全勾兑型果汁、廉价水果替代高价浆果的产品以及标签的符合性查验。
　　主要开展了浆果基因组DNA提取方法研究，对市场上常见的6种针对植物样品的商业试剂盒进行了比较和优化，并确定了PCR体系中的扩增酶。结果显示:Macherey-Nagel、TIANGEN和Magen试剂盒法所得DNA质量较差，DNA严重降解和污染;Qiagen、Promega和Biotecon试剂盒法均能得到质量较好的DNA，但Promega和Biotecon试剂盒法的DNA完整性低，扩增效率低于Qiagen试剂盒法提取的DNA。最后确定Qiagen试剂盒作为浆果分子检测中基因组提取的通用性方法。在扩增效率、保真性等的比较研究中，I-5TM2×High-Fidelity Master Mix在浆果DNA扩增中效果最好。
　　通过对不同条形码序列扩增效率、测序成功率、单片段和组合片段的物种分辨率评价，筛选出易于标准化、可靠性高的浆果DNA条形码序列。研究结果表明:短片段rbcL(250 bp)、psbA-trnH(450 bp)和长片段matK(890 bp)的浆果物种鉴定效果最好。其中，rbcL、psbA-trnH和matK序列的扩增成功率和测序成功率最高，均为100％。在单片段物种鉴别中，NCBI数据库比对中物种鉴定成功率为psbA-trnH=matK＞trnLc/d＞rbcL＞ BEL1/3＞BEL2/3＞trnLg/h，组合片段中matK+ psbA-trnH、rbcL+psbA-trnH和rbcL+trnLc/d可以提高物种的识别效率，但考虑到trnLc/d的扩增效率，最终选择rbcL、psbA-trnH和matK作为浆果DNA条形码序列。进一步构建的系统发育树验证3个序列NCBI鉴定结果的准确性。
　　另外，模拟不同加工方式对DNA断裂以致对检测结果的影响，建立了单一样品和混合样品基于Sanger测序的DNA条形码方法。结果显示，极端加工方式高温短时杀菌下短片段rbcL仍有扩增，psbA-trnH次之，matK严重降解。因此，短片段在极端处理下影响较小，基本可以用于所有浆果制品，而psbA-trnH和matK的应用范围小于rbcL序列。在模拟混合果汁的克隆测序中，鲜榨果汁、巴氏杀菌处理和高温短时杀菌处理均能检测到10％的目标浆果成分，部分甚至可以检测到1％，建立浆果单一样品直接测序和混合样品克隆测序的DNA条形码方法。
　　采用上述建立的DNA条形码鉴别方法，对市场采集的果干、果酱、浑浊果汁以及果汁饮料共计33份样品（5种果干、12种果酱、16种果汁和果汁饮料）进行了基于rbcL和psbA-trnH的DNA条形码序列鉴定。结果显示:33份样品中，检出成分同标签相符的占48.49％，与标签不符的占45.45％，失败6.06％。研究结果表明，DNA条形码技术可以用于市售浆果制品单一成分和复杂成分的真伪鉴别，为生产的质量控制以及进出口检验检疫监控提供新的控制和检测手段。

目录

声明

摘要

符号缩写

前言

文献综述

1 浆果真伪鉴别

1．1 浆果概述

1．2 感官鉴定

1．3 理化鉴定

1．4 DNA分子生物学鉴定

2 植物DNA条形码研究现状

2．1 DNA条形码概述

2．2 单片段DNA条形码

2．3 多序列组合DNA条形码

3 DNA条形码在植源性食品中的应用

3．1 农作物食品

3．2 保健食品

4 Sanger测序技术

5 研究目的与意义

第一章 浆果基因组DNA提取及PCR优化

1 材料与方法

1．1 实验材料与试剂

1．2 实验仪器与设备

1．3 实验方法

2 结果与分析

2．1 DNA纯度和产量

2．2 DNA扩增效果

2．3 PCR酶的选择

3 讨论

4 本章小结

第二章 浆果DNA条形码序列的筛选

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

1．2 仪器与设备

1．3 实验方法

2 结果与分析

2．1 PCR扩增成功率和测序成功率

2．2 物种鉴定能力评价

2．3 系统发育树分析

3 讨论

4 本章小结

第三章 基于Sanger测序技术的DNA条形码方法的建立

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

1．2 仪器与设备

1．3 实验方法

2 结果与分析

2．1 不同加工方式对DNA的影响

2．2 混合样品克隆测序结果

3 讨论

4 本章小结

第四章 市售浆果制品的DNA条形码物种鉴别应用

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

1．2 仪器与设备

1．3 实验方法

2．1 市售样品扩增结果

2．2 市售浆果制品检测结果

3 讨论

4 本章小结

全文结论

参考文献

致谢

硕士在读期间发表的论文