金鱼Tgf2转座酶的原核表达、纯化及DNA结合活性的研究

摘要

转座子不仅在转基因、插入诱变方面是很重要的遗传学工具，而且在基因治疗方面也是很好的DNA转运工具。脊椎动物转座子的转座酶大多在漫长的进化中会因来自宿主的纵向钝化(vertical inactivation)，而导致其突变失去活性，大部分成为非自主性转座子，不能够进行自主转座。然而，最近在金鱼体内发现了有活性的Tgf2转座子，它是继青鳉Tol2转座子之后发现的第二个具有天然活性的脊椎动物转座子，它属于 hAT(Hobo/Activator/Tam3)超家族转座子。金鱼 Tgf2转座子全长4720bp，能够编码三个不同长度的转座酶 mRNA。金鱼 Tgf2转座酶在斑马鱼胚胎中能够自主性调节切割，在金鱼体内也实现了其切割活性。
　　本研究小组从金鱼胚胎中分离得到的7种Tgf2转座子mRNA转录本出发，获得其编码的、不同区域缺失的3种转座酶，其中一种Tgf2转座酶全长cDNA编码673个氨基酸。体内合成的Tgf2转座酶具有识别转座子的特异序列，将其切离并整合到其他染色体中的转座活性，然而，通过基因重组的方法获得的Tgf2转座酶是否具有转座活性仍是未知的。目前对于Tgf2转座子的应用常是将转座酶mRNA和带有末端序列的供体质粒共同注射入胚胎，这个共同转染的过程可能会因转座酶的延迟翻译导致转基因的重复发生，直接注射转座酶可能会避免这些问题的发生。因此，本研究考虑在原核表达系统中采用融合表达的基因工程技术来制备Tgf2转座酶。
　　本研究实验主要分为四部分，第一部分主要内容为原核表达载体的构建。对Tgf2转座酶基因序列所在的克隆载体和两个表达载体pET-28a和pGEX-4T-1进行双酶切，将其连接起来，根据转座酶和载体序列设计引物，通过PCR检测，基因测序方法鉴定，结果表明，成功构建了两个原核表达载体 pET-28a-Tgf2TP和pGEX-4T-1-Tgf2TP。
　　第二部分主要内容为重组Tgf2转座酶的表达。本研究选择了两个表达宿主菌BL21(DE3)和Rosetta，重组质粒pET-28a-Tgf2TP在宿主菌BL21(DE3)中诱导表达，优化了表达时间，温度，IPTG浓度，通过SDS聚丙烯胺酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分析，在所有表达条件下都没有重组转座酶条带出现。重组质粒pGEX-4T-1-Tgf2TP在BL21(DE3)中表达，电泳图初步确定有重组转座酶的表达，还需要进一步鉴定是否是Tgf2转座酶。而重组质粒 pET-28a-Tgf2TP在宿主菌Rosetta1(DE3)中诱导表达，根据文献显示，22-25℃条件适合转座酶的表达，因此本研究选择在22℃条件下表达，对诱导温度没有优化。之后优化了诱导剂 IPTG浓度发现，IPTG浓度对可溶转座酶的表达量影响不大，选择了0.8mM IPTG作为最佳条件。研究结果表明低吸光度诱导（OD=0.3-0.4）比高吸光度（OD=0.6-0.7）诱导的Tgf2转座酶表达量多，并且低吸光度诱导（OD=0.3-0.4）随着时间的增加，转座酶的表达量逐渐增加；高吸光度诱导（OD=0.6-0.7）随着时间的延长，转座酶的表达量逐渐减少。因此本研究选择在22℃下，采用0.8mM IPTG浓度在低吸光度条件下长时间诱导。SDS-PAGE电泳表明，大约80kDa处有明显的蛋白条带，和预测的Tgf2转座酶分子量一致。
　　第三部分主要内容为重组转座酶的纯化及鉴定。通过 SDS-PAGE确定在宿主菌中能够表达可溶的转座酶，因此我们对菌液超声破壁后的上清液进行分离纯化重组转座酶。利用金属离子亲和层析（IMAC）和谷胱甘肽-琼脂糖介质对带有6×His和GST标签的融合蛋白进行纯化。SDS-PAGE电泳的分析表明，得到了高纯度的带有6×His标签的Tgf2转座酶。Western blot分析选用的一抗为抗His标签兔单克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔 IgG(H+L)，曝光显影后，PVDF膜上呈现出单一条带，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)也证明了纯化蛋白为Tgf2转座酶，因此，本实验确定Tgf2转座酶在Rosetta1(DE3)-pET28a表达系统中能够进行可溶性的表达，在BL21（DE3）-pGEX-4T-1系统中不能表达，通过镍柱能够纯化到较纯的转座酶，通过质谱确定纯化蛋白为Tgf2转座酶，这为进一步的功能性研究奠定了基础。
　　第四部分主要内容为重组Tgf2转座酶的DNA结合活性鉴定。Tgf2转座酶能够结合Tgf2转座子的末端重复序列，因此我们合成了Tgf2转座子左右末端50bp，使用生物素标记试剂盒标记这两段序列，然后将生物素标记的左右臂作为探针，通过电泳凝胶迁移率试验(EMSA)验证出重组Tgf2转座酶具有DNA结合活性，并且发现，不同浓度的Tgf2转座酶与左右臂探针结合的复合物在凝胶上的迁移率不同。Tgf2转座酶的可溶性表达及活性形式不仅为蛋白质工程的进一步研究奠定基础，而且为鱼类转基因提供一种新的酶工具。

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引言

第一章 金鱼Tgf2转座酶原核表达载体的构建

1材料

2方法

3结果

4小结与讨论

第二章 重组Tgf2转座酶的诱导表达

1材料

2方法

3结果

4结论与讨论

第三章 重组Tgf2转座酶的纯化及鉴定

1材料

2方法

3结果与讨论

4小结与讨论

第四章 重组Tgf2转座酶的DNA结合活性

1材料

2方法

3结果和讨论

4本章小结

结论与展望

1结论

2展望

参考文献

附录

致谢