冷却肉特定腐败菌的生物被膜特征与低温转录组学研究

摘要

食源性细菌的生物被膜现象在食品工业中广泛存在，这对食品的加工、卫生和安全有较大危害。然而关于食源性细菌生物被膜的研究多集中在致病菌，对腐败菌生物被膜的研究较少，对腐败菌生物被膜在食品体系中的作用研究更少。冷却肉的多种特定腐败菌都有潜在的生物被膜形成能力，但这些腐败菌生物被膜的形成规律、特征和调控机制仍然不清晰。此外，腐败菌生物被膜的形成是否与其致腐能力相关，低温冷藏过程中腐败菌的生物被膜形成规律和调控机制是什么，这些问题仍然研究不足。 针对以上问题，本研究以冷链物流环境中的冷却猪肉为着手点，在食品体系内和体系外对腐败菌的生物被膜展开了研究；在分析评估冷却猪肉和其冷藏托盘表面细菌生物被膜能力的基础上，鉴定获得了隆德假单胞菌（Pseudomonas lundensis）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）和液化沙雷菌(Serratia liquefaciens)三株生物被膜能力较强的肉类特定腐败菌，并观察了它们生物被膜的结构特征和形成规律；进一步在不同温度下研究了隆德假单胞菌和荧光假单胞菌在食品接触材料表面和在猪肉组织表面黏附和形成生物被膜的情况；并首次探索了低温下隆德假单胞菌生物被膜的形成规律及其与腐败性的关系，揭示了低温下隆德假单胞菌的生物被膜形成的转录组学机制。主要研究内容和结论如下： 1、分析评估了冷却肉中和超市冷藏销售托盘表面细菌的生物被膜形成能力，发现：冷却肉及其销售托盘表面的细菌能够形成生物被膜的比例较高。在腐败的冷却猪肉中和超市盛放冷却肉的销售托盘表面分别分离的79株和69株细菌中，生物被膜形成阳性率分别为79％和75％；其中具有较强生物被膜形成能力的细菌比例分别为37%和45％。冷却肉托盘表面中具有较强生物被膜形成能力的细菌比例略高于冷却肉中具有较强生物被膜能力的细菌。这对冷却肉质量安全的控制是较大风险。 2、从腐败冷却肉中分离鉴定了生物被膜能力较强的3株特定腐败菌，它们分别是：隆德假单胞菌（Pseudomonas lundensis106）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens113）和液化沙雷菌(Serratia liquefaciens25)。并通过结晶紫定量、扫描电子显微成像和激光共聚焦三维成像技术研究了这三株菌生物被膜的黏附特征、基本形成规律和三维结构特点。发现：隆德假单胞菌能在6~12h内大量黏附并形成较多生物被膜；该菌在30℃适宜的培养条件下，生物被膜的形成和扩散周期较短，在18h后生物被膜开始消散。荧光假单胞菌比隆德假单胞菌有更强的生物被膜形成能力，培养6h后开始明显黏附；18h后多糖分泌增多、菌体堆积并形成具有立体结构的生物被膜，在24h后形成具有立体性结构的生物被膜。液化沙雷氏菌的生物被膜形成能力低于荧光假单胞菌和隆德假单胞菌。该菌具有典型的生物被膜发展规律，生物被膜的形成开始于局部聚集，并不断增长，最终在24h后形成蘑菇状典型的成熟生物被膜。 3、针对目前缺乏在食品体系中研究腐败菌生物被膜的现状，以研究较少的隆德假单胞菌和荧光假单胞菌为对象，在不同温度下研究了它们在不锈钢和聚丙烯两种常见的食品接触材料表面的黏附特点和生物被膜规律，并首次尝试了用冷冻切片和免疫荧光法直接观察隆德假单胞菌和荧光假单胞菌在猪肉组织表面的黏附情况和生物被膜状结构的特点。发现：隆德假单胞菌和荧光假单胞菌在30℃的适宜温度下能够在不锈钢和聚丙烯表面上黏附并形成大量生物被膜。在4℃的冷藏温度下，这两种特定腐败菌也能在不锈钢和聚丙烯材料表面形成生物被膜，但荧光假单胞菌的黏附和被膜能力更强。在肉类体系的研究发现：30℃下隆德假单胞菌能够在猪肉提取液中形成较多生物被膜，而在4℃下形成量较少；荧光假单胞菌无论在30℃下还是在4℃下都能形成大量生物被膜。在4℃冷藏的猪肉组织中，两种腐败菌都能在猪肉表面黏附定殖并形成生物被膜样结构，这种结构在猪肉腐败末期（4-8d）较明显。 4、针对目前几乎没有关于隆德假单胞菌生物被膜的研究的现状，本文以隆德假单胞菌野生菌株和标准菌株为对象，首次研究了该菌低温下的生物被膜形成规律，测定了该菌的生物被膜与蛋白酶产量关系和对猪肉盐溶蛋白的分解能力，探索该菌生物被膜在其致腐能力中的作用。研究结果发现：隆德假单胞菌的野生菌株106和标准菌株6252在10℃和4℃低温条件下比在30℃下具有更强的生物被膜形成能力，且标准菌株6252的生物被膜能力强于野生菌株106。在各个温度下，两株菌生物被膜的形成均呈倒“V”型发展，而且它们的生物被膜形成量都在30℃下培养12h，在10℃下培养72h、在4℃下培养120h时分别达到最大。此外，10℃和4℃的低温条件还能使两株假单胞菌已形成的生物被膜增加。隆德假单胞菌106和6252在10℃下生物被膜中的蛋白酶活力高于浮游菌培养液中的蛋白酶活力。隆德假单胞菌野生菌株106和标准菌株6252的生物被膜菌混合后比浮游菌具有更强的分解猪肉盐溶蛋白的能力。这些结果表明：隆德假单胞菌在低温下形成更多的生物被膜可能有助于提高其致腐能力。 5、为进一步探索隆德假单胞菌的生物被膜形成机制，针对隆德假单胞菌在低温下能够形成更多生物被膜的现象，采用全基因转录组学比较了隆德假单胞菌标准菌株6252在4℃和30℃下的基因转录差异，尝试揭示低温下该菌的生物被膜形成增加的机制。通过转录组测序和生物信息学分析发现：在4℃和30℃下的隆德假单胞菌生物被膜菌的代谢明显不同，共有4418个差异表达基因，有1419个显著差异表达基因。对获得的差异基因进行COG、GO、KEGG富集分析发现：在30℃下和4℃下，与细菌生物被膜形成相关的鞭毛运动性调节系统、细菌趋化性调节途径和双组份表达系统有显著差异，这表明该菌可以通过这三种系统的改变调节生物被膜的形成。与30℃相比，隆德假单胞菌在4℃的低温条件下通过减少鞭毛成合，进而降低运动性而使生物被膜的形成量更多。而在低温条件下隆德假单胞菌鞭毛合成减少的原因与低温下菌体代谢速率降低、对氧利用率下降和环二鸟苷酸（c-di-GMP）增加有关。低温也可能直接导致了生物被膜菌中环二鸟苷酸 c-di-GMP合成量增加，并导致了藻多糖和荚膜多糖的合成基因表达有显著上调，这也促进了生物被膜的增加。这都是导致隆德假单胞菌在4℃下比在30℃形成更多生物被膜的原因，其中氧利用率的降低和 c-di-GMP合成量的增加是最主要原因。 综上所述，本文分析评估了冷却肉中和超市冷藏销售托盘表面的细菌的生物被膜形成能力，证实了冷却肉及其销售托盘表面细菌能够形成生物被膜的比例较高，生物被膜是影响冷却肉质量安全的危险因子。首次研究了隆德假单胞菌的生物被膜形成规律、微观结构特征和低温下形成量增加的转录组学机制，为进一步研究该腐败菌的生物被膜和代谢特性提供了基本理论基础。首次尝试并在猪肉组织表面观察了隆德假单胞菌和荧光假单胞菌的黏附和生物被膜特点，并探索了隆德假单胞菌生物被膜与其致腐能力之间的关系。这都为认识特定腐败菌的致腐作用提供了新的理论参考，也为进一步研究和控制腐败菌的生物被膜危害提供了理论依据。

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第一章 引 言

1.1冷链环境下冷却肉类中的腐败微生物

1.2食源性细菌的生物被膜（Biofilm）

1.3细菌生物被膜的形成与调控

1.6问题的提出及研究意义

第二章 冷却肉中及托盘表面形成生物被膜的细菌分析与鉴定

2.1 材料与方法

2.2 结果与讨论

2.3 本章小结

第三章 冷却肉中三种特定腐败菌的生物被膜结构特点研究

3.1 材料与方法

3.2结果与讨论

3.3本章小结

第四章 特定腐败菌在食品接触面和肉表面的生物被膜特点研究

4.1 材料与方法

4.2结果与讨论

4.3 本章小结

第五章 低温下隆德假单胞菌生物被膜形成规律和致腐作用研究

5.1 材料与方法

5.2结果与讨论

5.3本章小结

第六章 温度对隆德假单胞菌生物被膜形成影响的转录组学研究

6.1 材料与方法

6.2结果与分析

6.3 本章小结

第七章 全文总结与展望

7.1 全文总结

7.2 创新性说明

7.3 论文的不足和展望

参考文献