对虾特定腐败菌生物被膜的形成特性及抗菌脂肽的控制作用

摘要

凡纳滨对虾营养丰富，一定条件下会促进特定腐败菌的生长繁殖，对虾加工环境为腐败菌形成生物被膜提供了极其有利的条件。凡纳滨对虾常见的特定腐败菌又称为特定腐败菌（Specific spoilage organisms，SSO）有金黄杆菌、假单胞菌、希瓦氏菌和摩根菌，它们易粘附在食品接触面甚至在虾壳表面形成生物被膜，不但会腐蚀设备、形成生物污垢、降低热传导效率，更重要的其能成为隐蔽的污染源，造成产品的持续或交叉污染，缩短货架期，影响产品的安全性。本研究的目的在于了解凡纳滨对虾常见4种特定腐败菌形成生物被膜的能力，并从中筛选出成膜能力较强的一株腐败菌为代表，研究其生物被膜的形成特性和纳豆芽孢杆菌的发酵产物抗菌脂肽AMPNT-6对该菌产生物被膜的控制。研究结果分析如下：
　　以凡纳滨对虾四种特定腐败菌金黄杆菌（Chryseobacterium）SL-4、假单胞菌（Pseudoalteromonas）SL-1、腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）SL-3、摩根菌（Morganella）SL-11为研究对象，采用试管结晶紫染色法，研究不同培养基、接触面对腐败菌生物被膜形成的影响，利用96微孔法研究不同菌株之间形成生物被膜的情况，通过普通光学显微镜观察玻片上生物被膜的黏附情况，并用扫描电镜观察不同接触面上腐败菌生物被膜的结构特性。结果表明，在 LB、TSB、BHI培养基中，形成生物被膜OD600值最大的是假单胞菌，其余依次为金黄杆菌、希瓦氏菌、摩根菌；并且四种腐败菌在LB培养基中形成生物被膜的量均较多，其次是在BHI培养基中，在 TSB中形成生物被膜的能力相对最低；在聚乙烯塑料片上，生物被膜的形成能力强弱依次为假单胞菌、希瓦氏菌、金黄杆菌、摩根菌；在不锈钢片上，生物被膜形成能力强弱依次是希瓦氏菌、假单胞菌、金黄杆菌、摩根菌。显微镜观察发现假单胞菌和希瓦氏菌在玻片上粘附面积较大，而且比较致密，金黄杆菌和摩根菌相对而言较为松散。同时在扫描电镜下观察到，在聚乙烯塑料片上，假单胞菌和希瓦氏菌形成致密的矩阵状被膜组织，并有微孔洞镶嵌在被膜上；在不锈钢片上，金黄杆菌也形成矩阵状被膜组织，希瓦氏菌形成多层次的较为致密的网络状被膜结构；其它腐败菌均相互粘附且较为松散。多种腐败菌共同培养形成生物被膜的能力较单一菌种的形成能力强的强，腐败希瓦氏菌能促进其它菌株的成膜能力。综合评估，发现希瓦氏菌在LB培养基中于不锈钢片上形成生物被膜的能力最强，确定希瓦氏菌为为下一步试验菌株。
　　采用改良的96微孔板法，通过改变环境因素，研究不同培养时间、菌体浓度和不同理化因子、几种胁迫条件对腐败希瓦氏菌生物被膜形成能力的影响；并分别通过玻璃试管法研究不同基质及其浓度对希瓦氏菌成膜能力的影响；利用扫描电镜观察以不锈钢片为接触面对希瓦氏菌生物被膜形态结构的影响。结果显示，希瓦氏菌在 LB培养基中静置培养约24h形成成熟的生物被膜；在各实验条件下，分别以30℃培养，2％NaCl浓度，pH为中性或略偏碱性，起始菌浓度为106-107CFU/mL时形成生物被膜的量最大。希瓦氏菌在不锈钢片上形成成熟的生物被膜需要60h，扫描电镜观察其形态为立体网络状结构，被膜上镶嵌有微孔道，内部呈有规律的褶皱结构。基质的浓度和种类也会影响希瓦氏菌生物被膜的形成，如质量浓度在20%以内，希瓦氏菌在LB、虾汁液中形成生物被膜的能力无显著差异，但浓度高于20%时，希瓦氏菌更容易在虾汁液中形成生物被膜。而Ca2+和一定浓度的Mg2+会抑制腐败希瓦氏菌生物被膜的形成；葡萄糖的添加量对生物被膜的形成没有明显的影响。几种胁迫条件如抗菌剂（75%酒精、H2O2、84消毒液、乙酸）的存在对希瓦氏菌的成膜能力无显著影响，但0.3%的NaClO会促进生物被膜的形成。
　　牛津杯试验发现纳豆芽孢杆菌的发酵产物抗菌脂肽AMPNT-6对腐败希瓦氏菌有较好的抑菌活性，抑菌圈能到达（23.14±1.43）mm，MIC值为0.3125mg/mL。采用试管结晶紫染色法可以得知AMPNT-6对不锈钢片、虾壳上的生物被膜均有较好的控制作用，其中抗粘附效果较清除作用好，2MIC的AMPNT-6即可对将生物被膜控制在较低的水平。微孔试验研究得出：2MIC的AMPNT-6作用3h即可很好的抑制生物被膜的形成，作用24h达到最佳的清除效果。
　　初始阶段加入 AMPNT-6，其主要作用于菌体，达到抗粘附的效果；生物被膜成熟后加入 AMPNT-6，其主要对胞外多聚物发生作用，达到对生物被膜的清除效果。扫描电镜图显示抗粘附的过程中，AMPNT-6可以使菌体破损及阻止细菌的粘附来抑制被膜的形成；清除的过程中，AMPNT-6会破坏生物被膜的组织结构，使被膜发生脱落。3MIC的AMPNT-6可以完全杀灭菌体、抑制胞间多糖黏附素（Polysaccharide intercellular adhesion，PIA）的产生和对胞外多糖（Exopolysaccharide，EPS）的抑制达到最佳效果，从而完全抑制生物被膜的形成以及清除生物被膜。

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1 绪论

1.1 研究目的与意义

1.2 国内外研究状况

1.3本课题的研究内容和创新意义

2 凡纳滨对虾特定腐败菌生物被膜的形成能力评估

2.1 材料与仪器

2.2 实验方法

2.3 结果

2.4讨论

2.5 小结

3 加工环境中腐败希瓦氏菌生物被膜形成特性研究

3.1 材料与仪器

3.2 试验方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 小结

4 抗菌脂肽对腐败希瓦氏菌生物被膜的抗粘附和清除作用

4.1 材料与仪器

4.2 试验方法

4.3 结果

4.4讨论

4.5 小结

5 抗菌脂肽对腐败希瓦氏菌生物被膜作用机理的初步研究

5.1 材料与仪器

5.2 试验方法

5.3 结果

5.4 讨论

5.5 小结

6 总结与展望

6.1 总结

6.2 不足之处与展望

参考文献

致谢

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