水产品弧菌的等温核酸扩增可视化检测方法的建立与应用

摘要

弧菌属是一类广泛存在于海水、海产品中的细菌。其中有十几种是能够引起人疾病的病原菌，引起最多死亡率的是霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌。海产品或其他食品中的弧菌是通过人摄入或者伤口感染至体内引起呕吐、腹泻等一系列胃肠道疾病或败血症甚至死亡。生食海鲜的文化根深蒂固，却成为弧菌等病原菌对人体健康不利的通道。随着生食饮食文化的传播，由弧菌引起的弧菌病报道也受到了关注。弧菌的快速检测和控制就成为了传承饮食文化和维护人们安全健康的一个特别重要的途径。由于传统的PCR方法的灵敏度、耗时等问题，受到了自身的限制，所以有越来越多的研究关注于寻求更加适合即时检测需求的方法。
　　金纳米颗粒是符合量子点的具有良好光学性质一种材料。能够通过合成不同的尺寸和形状，来获得不同的光学性质。在近几年来，金纳米颗粒已经被引入生物感应器中，解决了实际问题，取得了很大的进展。近十几年来，等温核酸扩增的开发在各个领域得到了广泛的应用。金纳米颗粒在等温核酸扩增技术中的作用发挥势必会带了更大的突破。本研究以此为研究主旨，分析了环介导等温核酸扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）和重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)的反应体系中各个组分与金纳米颗粒之间的关系，摸索最佳反应条件。建立了基于重组酶聚合酶扩增技术对霍乱弧菌的检测，并引入了金纳米颗粒参与反应。构建了一套完整系统的方法，实现快速、低成本、灵敏可靠的可视化检测。为基础实验室和检测平台提供高效的技术手段，为食源性致病菌的防控和食品安全监测提供了技术支撑。主要研究结果如下：
　　1、通过与qPCR方法对比，我们报道的RPA方法较为灵敏、快速和可靠，在不依赖昂贵设备仪器的条件下能够定量检测海产品中的霍乱弧菌。这种方法在10分钟内实现的检出限为5个拷贝，在八个独立的检测实验中具有很高的可重复性。基于lolB基因，RPA的特异性是霍乱弧菌物种内高度保守的。RPA在食品行业中的可应用性通过检测45个对虾样品来验证。总之，RPA方法是灵敏、快速的检测方法，甚至可以量化海产品中的霍乱弧菌。
　　2、在霍乱弧菌 RPA扩增反应的基础上，建立了一个基于RPA与纳米金材料的可视化检测方法。首先，发现在RPA反应体系中103个拷贝质粒标准品DNA在6 min后才扩增出，而AuNPs-RPA反应体系中同样浓度的质粒标准品DNA较RPA在5.3 min已有扩增信号，其他浓度下均出现AuNPs-RPA比RPA早起信号。说明金纳米材料可以提高 RPA的反应速率，使得加速了反应启动。其次，阐述了 RPA中蛋白组分和引物与金纳米颗粒之间的相互作用，为稳定金纳米材料提供一个理论基础。在扩增完成之后，观察颜色变化，发现不同加样顺序和是否进行引物孵育 AuNPs过程会影响颜色的结果。结果发现，如果引物先与金纳米颗粒孵育，然后加上酶，会使对金的保护力保持在最高水平，这时将不会出现实验组和对照组的颜色对比。在酶失活后再加金，因酶的构象发生变化，此时再加金进去，体系中大量盐离子得以让金团聚；把溶液调至酶的等电点附近，实验组和对照组都发现了沉淀现象；在加酶前让引物和探针与金孵育过夜，实验组和对照组均始终保持红色,结果显示体系中的混合酶起到了保护金的作用而且是大分子的酶在空间上起到的保护和较强的吸附作用。为呈现定性可视化结果，需先加酶后加引物，最终有阳性结果的颜色为蓝色，阴性结果的颜色为紫红色。原因是重组酶缠绕引物形成引物-酶聚合物，使得引物和酶都失去了金保护功能。虽然发生扩增反应，双链DNA无法弥补一些保护功能，对照组因没有扩增使得重组酶和引物一直缠绕或始终处于缠绕释放的动态平衡。总之，金纳米颗粒能够提高RPA的反应速率，并能定性地显示结果，对RPA basic试剂盒的用户而言，缩短了终点分析的时间，降低了实验成本。所以，本研究可以给使用 RPA基础试剂盒的研究者提供简便的终点分析可视化方法。
　　3、基于 SH修饰引物的AuNPs-LAMP体系的研究内容包括：首先确定了ssDNA、dsDNA、dNTP、Bst DNA聚合酶对AuNPs的影响。结果发现，ssDNA、dsDNA、dNTP能使AuNPs分散系稳定，而Bst DNA聚合酶对其有非特异性吸附，而使AuNPs之间因Bst DNA聚合酶而聚集在一起。
　　其次建立的方法中包括较为特别的方式加入金，以提高金的稳定性和检测的方便度。用AuNPs稀释引物，形成红色引物，同时让SH修饰的引物与AuNPs自我组装，摒弃了繁琐的锚定步骤。摸索最佳反应条件：温度参数设置范围为61-65℃；时间范围在30-65 min内；选用16 nm直径AuNPs浓度2.3 nM、11.5 nM、23 nM、46nM。获得最佳反应条件，即63℃55 min，采用AuNPs23 nM。
　　最终将该可视化方法应用于检测副溶血性弧菌，确定了它的最低检测限，在55 min内达到了定性和200 pg以上可半定量的结果，阳性结果和阴性结果可以根据管内产物颜色是否为红色或者蓝色鉴别。
　　4、基于PEG空间位阻剂的未修饰AuNPs参与LAMP比色法检测，提出了采用 PEG减少金纳米颗粒之间的碰撞几率，增加空间稳定性的机理，并用实验结果一一进行验证。摸索PEG浓度从9％至39%，最终发现最佳浓度为39%。
　　基于两种原理，PEG-AuNPs和SH引物-AuNPs LAMP两种方法进行对比，发现颜色变化正好相反，阳性结果呈蓝色，阴性结果呈红色。以副溶血性弧菌和创伤弧菌为研究对象，加入两者各自的靶向引物，实现多重检测， PEG-AuNPs方法也能在63℃条件下55 min内100fg以上的半定量检测，比SH引物-AuNPs较为灵敏。因此，PEG-AuNPs方法可成为半定量可视化检测手段，虽以弧菌的特异性检测为目的，但可普及到其他病原体或其他目标物的核酸检测，为基础实验室和检测平台提供高效的技术手段，为食源性致病菌的防控和食品安全监测提供了技术支撑。
　　整体来看，金纳米颗粒材料参与的等温核酸扩增反应体系能够很好地适应即时检测的需求，不受大型仪器的束缚，在可视化检测中具有良好的应用前景。在可视化的同时，还能避免交叉污染、提高反应速率或进行多重检测。

目录

声明

引言

第一章 绪论

1.1水产品中主要致病菌弧菌概述

1.2 金纳米材料在DNA检测中的应用

1.3 主要研究目的、意义及创新点

第二章 基于重组酶聚合酶等温核酸扩增技术的水产品中霍乱弧菌快速检测方法的建立

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3结果与讨论

2.4本章小结

第三章 金纳米颗粒参与的RPA比色法检测的条件优化

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3结果与讨论

3.4本章小结

第四章 基于SH修饰引物和未修饰金纳米颗粒参与的LAMP可视化检测的条件优化

4.1实验材料

4.2实验方法

4.3结果与讨论

4.4本章小结

第五章 空间位阻介导未修饰金纳米颗粒参与的LAMP比色法检测的条件优化

5.1实验材料

5.2实验方法

5.3结果与讨论

5.4本章小结

第六章 AuNPs-LAMP 在水产品中弧菌检测上的应用及AuNPs-等温核酸扩增方法的比较

6.1 实验材料

6.2 实验方法

6.3实验结果与讨论

6.4本章小结

第七章 结论与展望

7.1 基于AuNPs的RPA可视化检测

7.2 基于AuNPs的LAMP可视化检测

7.3 不足与展望

参考文献

附录

致谢

攻读博士期间发表的相关论文与工作成果