基于Cre/LoxP系统的Smad2条件基因打靶小鼠的建立

摘要

Smads家庭是最新发现的TGF-β信号转导途径中一个重要的新基因家族,它们可以直接将TGF-β信号从细胞膜转移到细胞核内.SMAD2属于受体激活的SMADs.为了进一步研究Smad2在成体各组织器官及肿瘤发生中的可能作用,我们需要构建Smad2条件基础打靶小鼠.我们利用Cre/LoxP系统构建了构建Smad2条件基因打靶载体,将两个方向相同的LoxP序列置于编码SMAD2蛋白C末端功能域序列两侧的内含子中,并在组成型表达Cre重组酶的大肠杆菌中检测了LoxP位点的有效性.

目录

摘要

前言

第一部分：Smad2条件基因打靶载体的构建及LoxP位点有效性鉴定

1材料和方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果

2.1小鼠Smad2的3’端基因组片断p3-1B的酶切图谱分析和打靶载体的构建策略

2.2打靶载体的构建和酶切鉴定

2.3利用组成型表达Cre重组酶的细菌鉴定打靶载体的有效性

3讨论

参考文献

第二部分：G418抗性的小鼠胚胎干细胞滋养层的制备与ES细胞的培养

1材料与方法

1.1实验材料

1.2主要试剂

1.3小鼠胚胎的获取与处理

1.4原代小鼠胚胎成纤维细胞分离和培养

1.5 PCR鉴定小鼠胚胎成纤维细胞基因型

1.6小鼠胚胎成纤维细胞滋养层的制备

1.7 ES细胞的培养

2结果和讨论

2.1 PCR鉴定小鼠胚胎成纤维细胞基因型

2.2 小鼠胚胎成纤维细胞的生长行为

2.3 滋养层细胞对ES细胞生长的支持作用

参考文献

第三部分：中靶ES细胞的筛选和鉴定

1材料与方法

1.1线性化打靶载体DNA的制备

1.2电击法转染ES细胞

1.3阳性ES克隆的挑取

1.4阳性ES克隆的冻存

1.5 ES克隆基因组DNA的制备

1.6 DNA放射性探针的标记和纯化

1.7 Southern杂交法筛选中靶ES细胞

2结果

2.1中靶ES细胞的筛选

2.2中靶ES细胞的鉴定

3讨论

参考文献

第四部分：囊胚注射制备Smad2条件基因打靶小鼠

1材料与方法：

1.1供体囊胚的制备

1.2囊胚的显微注射

2结果

2.1 Smad2中靶ES细胞嵌合体小鼠的制备

2.2 Smad2条件基因打靶小鼠的基因型鉴定

3讨论

参考文献

总结

博士在读期间发表论文

致谢

综述：基于Cre/LoxP重组酶系统的条件基因打靶