枸杞糖缀合物LbGp4及其糖链LbGp4-OL与小鼠B淋巴细胞结合位点的研究

摘要

本研究主要主要研究了枸杞糖缀合物LbGp4及其糖链LbGp4-OL与淋巴细胞的作用方式，探讨了其在B细胞上的特异性结合位点及其活化B细胞的初步分子机理。 一、3H-LbGp4及3H-LbGp4-OL与B淋巴细胞的结合应用放射配基结合实验分别研究了3H-LbGp4及3H-LbGp4-OL与B淋巴细胞的结合特性。结果表明，3H-LbGp4达到5.82pM时与B细胞的特异性结合趋向饱和，平衡解离常数Kd=2.973pM，亲和常数K=0.3364pM-1，提示3H-LbGp4与B淋巴细胞的结合具有较强的亲和力。最大结合Bmax=14.50fM。受体动力学研究表明，结合时相参数(平衡时结合配基的浓度)RLeq=12.25fM，有效速度常数(k12×L*+K21)为O.1464fM/min，t1/2=4.734min；解离时相参数k21=-0.0137，t1/2=50.58min。 3H-LbGp4-OL与静息B细胞的结合亦具有较好的饱和性，其结合参数Kd=2.4131pM，Bmax=89.82fM，亲和常数K=0.4144pM-1，提示3H-LbGp4-OL与静息B细胞结合具有较好的饱和性和特异性，亲和性较强。受体动力学研究结果表明，结合时相参数Rleq=21.48909fM，有效速度常数(k12×L*+k21)为0.0224fM/min，t1/2=30.94min；解离时相参数k21=-0.023，t1/2=30.13min。当加入4.7至10.0μM非标LbGp4-OL时，3H-LbGp4-OL与B细胞的特异性结合量变化最明显，当非标LbGp4-OL低于4.7μM或大于10.0μM均对其特异性结合无明显影响，表明3H-LbGp4-OL与B细胞的特异性结合具有较强的亲和性。 二、构成LbGp4及LbGp4-OL的单糖对3H-LbGp4及3H-LbGp4与B细胞结合的影响LbGp4的糖链由四种单糖组成，即阿拉伯糖(阿)、半乳糖(半)、鼠李糖(鼠)和木糖(木)，其组成比为1.5：2.5：0.43：0.23。同时应用阿、半、鼠、木四种单糖或阿、半、鼠三种单糖可阻断3H-LbGp4与静息B细胞的特异性结合，但阿、半或半、鼠两种单糖同时应用时对3H-LbGp4与B细胞的特异性结合无阻断作用，而木糖的存在与否不影响3H-LbGp4与静息B细胞的特异性结合。应用荧光素FITC标记LbGp4-OL，然后进行与静息B细胞的饱和实验，结果与放射配基结合实验相似，但亲和力较低。 LbGp4-OL由三种单糖组成，分别为阿、半和鼠，其组成比为1.33：1.0：0.05。同时应用三种单糖对3H-LbGp4与静息B细胞的特异性结合有阻断作用，而分别应用以上三种单糖任何两两组成对3H-LbGp4与静息B细胞的特异性结合均无明显阻断作用。 三、不同浓度糖链构成单糖对3H-LbGp4-OL与静息B细胞结合的影响按比例混合阿、半、鼠三种单糖，分别观察是正常浓度1倍、0.8倍、0.6倍、0.4倍和0.2倍时对3H-LbGp4-OL与静息B细胞特异性结合的影响。结果表明，随浓度的增高，阻断作用增强。 四、FITC-LbGp4-OL与静息B细胞结合的饱和实验应用荧光素FITC标记LbGp4-OL，然后进行与静息B细胞的饱和实验。结果表明，FITC-LbGp4-OL与静息B细胞的结合具有较好的饱和性；Scatchard作图曲线呈直线分布，Kd=232.56pM，Bmax=162.70fM，亲和常数K=0.0043pM-1，提示HTC-LbGp4-OL与静息B细胞的特异性结合具有较好的饱和性，但亲和性较低。 五、3H-LbGp4-OL与其它组织细胞结合的饱和实验分别观察了3H-LbGp4-OL与成年大鼠睾丸间质细胞、胚胎大鼠海马及下丘脑神经细胞以及小鼠脾T淋巴细胞的结合情况。实验结果表明，3H-LbGp4-OL与上述组织细胞均无饱和性，总结合与非特异性结合几乎完全重叠；Scatchard曲线呈不规律分布，提示3H-LbGp4-OL与上述组织细胞无特异性结合。 六、LbGp4-OL与静息B细胞结合部位的定位研究应用荧光素标记LbGp4-OL，然后按受体饱和实验的方法与静息B细胞孵育，应用激光共聚焦显微镜(Confocal)观察FITC-LbGp4-OL与B细胞的结合情况，然后选择荧光细胞进行断层扫描，观察荧光分布情况。结果表明，FTTC-LbGp4-OL结合于B细胞表面，提示LbGp4-OL的特异性结合部位位于细胞膜。 七、LbGp4和LbGp4-OL对B细胞蛋白激酶C活性的影响将LbGp4(2.32，1.16，0.58nM)和LbGp4-OL(2.76，1.38，0.69nM)与B细胞共同孵育，进而测定B细胞蛋白激酶C(PKC)活性。结果表明，LbGp4和LbGp4-OL对B细胞PKC活性无明显影响。 八、LbGp4和LbGp4-OL对B细胞酪氨酸激酶活性的影响将LbGp4(2.32，1.16，0.58nM)和LbGp4-OL(2.76，1.38，0.69nM)与B细胞共同孵育，进而测定蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性。结果表明，LbGp4和LbGp4-OL可明显提高B淋巴细胞PTK活性。LbGp4提高PTK活性分别是对照组的202.73％，160.28％和127.77％；LbGp4-OL提高PTK活性分别是对照组的250.77％，191.49％，145.24％。 第4页九、LbGp4和LbGp4-OL对B细胞核转录因子NF-κB和BSAP的影响 结果表明，LbGp4和LbGp4-OL对核因子NF-κB表达具有明显的上调作用，加入LPS或PWM则对NF-κB蛋白表达无明显影响。LbGp4和LbGp4-OL对B细胞特异性活化蛋白BSAP的表达具有明显的上调作用，加入LPS或PWM后对BSAP的蛋白表达有下调的趋势，加入PWM后其作用尤为明显。

目录

英文缩写词表

第一章前 言

第二章材料与方法

一、实验材料

1.动物

2.枸杞糖缀合物及其糖链

3.试剂

4.仪器

二、方法

(一)小鼠脾脏B淋巴细胞的制备

(二)饱和实验

(三)竞争性抑制实验

(四)结合时相曲线

(五)解离时相曲线

(六)3H-LbGp4、3H-LbGp4-OL标记和纯度鉴定

(七)FITC-LbGp4-OL标记和纯度鉴定

(八)荧光标记LbGp4-OL的饱和实验

(九)FITC-LbGp4-OL与静息B细胞结合的图象分析

(十)单糖拮抗实验

(十一)LACA小鼠脾脏T淋巴细胞的制备

(十二)凝胶阻滞电泳(EMSA)

(十三)胚胎大鼠原代海马神经细胞的培养

(十四)睾丸间接细胞的制备

(十五)蛋白免疫印记实验(Western blotting analysis)

(十六)蛋白激酶C的提取和测定

(十七)酪氨酸激酶(Tyrosine kinase assay)的提取测定

三、统计学处理

第三章实验结果

一、3H-LbGp4对B淋巴细胞的结合

二、3H-LbGp4-OL对B淋巴细胞的结合

三、构成LbGp4的单糖对3H-LbGp4与B细胞结合的影响

四、构成LbGp4-OL的单糖对3H-LbGp4-OL与B细胞结合的影响

五、不同浓度糖链构成单糖对3H-LbGp4-OL与静息B细胞结合的影响

六、FITC-LbGp4-OL与静息B淋巴细胞结合的饱和实验

七、3H-LbGp4-OL与大鼠睾丸间质细胞结合的饱和实验

八、3H-LbGp4-OL与胚胎大鼠海马神经细胞结合的饱和实验

九、3H-LbGp4-OL与胚胎大鼠下丘脑神经细胞结合的饱和实验

十、3H-LbGp4-OL对T淋巴细胞结合位点的饱和实验

十一、LbGp4-OL与静息B细胞部位的研究

十二、LbGp4和LbGp4-OL对B淋巴细胞蛋白激酶C活性的影响

十三、LbGp4和LbGp4-OL对B淋巴细胞酪氨酸激酶活性的影响

十四、LbGp4和LbGp4-OL对B淋巴细胞核转录因子NF-κB和BSAP的影响

第四章讨论

一、3H-LbGp4和3H-LbGp4-OL与B淋巴细胞的结合特征

二、LPS、PWM和ConA不能完全拮抗3H-LbGp4与B淋巴细胞的特异性结合

三、3H-LbGp4和3H-LbGp4-OL构成单糖中阿拉伯糖、半乳糖和鼠李糖是其与B细胞结合的必需糖

四、LbGp4-OL的细胞结合位点主要位于B淋巴细胞

五、LbGp4-OL与B淋巴细胞的特异性结合位点位于细胞膜

六、LbGp4-OL与B淋巴细胞结合后所启动的跨膜信号转导途径

第五章结论

参考文献

蛋白激酶C和lκB/NF-κB在免疫调节中的作用

BSAP/Pax-5在B淋巴细胞发育、增殖、分化中的作用

博士后工作期间论文出版情况

简历

致谢