丹参糖蛋白的分离纯化与生物活性研究

摘要

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)系鼠尾草属植物，是一味常用中药，以其干燥根茎入药，可用于治疗冠心病、中风、微循环障碍等疾病。丹参中脂溶性有效成分为丹参酮类，具有抗菌作用；水溶性有效成分为酚酸类，具有抗氧化，改善心肌缺血等药理作用。目前对于丹参活性成分的研究仅限于以上两类小分子物质，而对于极具开发前景的活性多糖及糖蛋白类物质的研究报道较少。为了进一步开发利用丹参资源，本课题选取丹参为材料，采用现代分离分析技术对丹参糖蛋白组分进行了分离、纯化，并对纯化组分进行了组成及结构测定，采用现代功能评价方法对粗提物的体外抗氧化活性和对小鼠的免疫调节活性进行了初步研究，试验主要结论如下： 1．采用热水浸提法提取丹参糖蛋白，正交试验得出最佳提取条件为：料液比1∶20、浸提温度70℃、浸提时间4h、NaCl浓度0.1mol/L，糖蛋白得率为4.68％。 2．采用超声辅助法提取丹参糖蛋白，正交试验得出最佳提取条件为：超声功率250W、超声处理20 min、NaCl浓度0.05mol/L料液比为1∶20，糖蛋白得率为6.89％。 3．丹参糖蛋白精制的最佳条件为：Sevage法去除游离蛋白7次，80％的乙醇沉淀，糖蛋白得率为5.03％。 4．丹参糖蛋白精制品为(CSGP)糖含量51.24％，蛋白质含量37.34％的不含淀粉、还原糖、多酚类物质的酸性物质，利用气相色谱法、氨基酸自动分析仪、紫外光谱法、红外光谱法对该提取物的单糖、氨基酸组成、光谱学特征进行了研究，结果表明该提取物含有17种已测定的氨基酸和8种单糖，存在大量的O-糖肽键，初步获得了该提取物的光谱学特征图谱。 5．丹参糖蛋白精制品(CSGP)经DEAE-52离子交换纤维素柱层析和SephadexG．200凝胶柱层析分离出CSGP-1-a、CSGP-1-b、CSGP-3′、CSGP-4′四种组分，其纯度鉴定分别采用琼脂糖凝胶电泳和Sepharose CL-6B凝胶柱层析法，结果表明四种组分均为均一组分。 6．气相色谱、紫外光谱、红外光谱、理化特性分析结果表明，CSGP-1-a糖含量为95.4％，α、β糖苷键同时存在，是主要由葡萄糖组成的硫酸化多糖，分子量87.6kD，比旋光度+52.3°；CSGP.1-b、CSGP-3′、CSGP-4′均是酸性糖蛋白，糖含量分别为89.5％，79.3％，92.5％，蛋白质含量分别为2.5％、19.6％，7.9％；分子量分别为65.4kD、55.8kD、42.3kD，比旋光度分别为+89.6°、+132.5°、+99.5，在三种组分中葡萄糖、半乳糖含量均较高，且均存在O-糖肽键；其中CSGP-3′、CSGP-4′含有少量磺酸基和硫酸基。 7．氨基酸分析结果表明，除CSGP-1-a未检测出氨基酸外，CSGP-1-b、CSGP-3′、CSGP-4′均含有所测定的17种氨基酸，其中天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸含量均较高，构成植物糖蛋白O-糖肽键的丝氨酸、酪氨酸含量也较高。 8．丹参糖蛋白(CSGP)对NADH/PMS体系产生的超氧阴离子自由基，对Fenton反应体系产生的羟基自由基均有显著的清除作用，并呈一定的剂量效应关系，对DPPH自由基具有一定的清除作用，无明显剂量效应关系；其中对超氧阴离子自由基、羟基自由基的清除率与同浓度Vc相当。 9．丹参糖蛋(CSGP)的乙醇分级组分CSGP-A、CSGP-B、CSGP-C对超氧阴离子自由基、羟基自由基均有不同程度的清除作用，以半数清除率浓度(IC<,50>)进行比较，对两种自由基的清除能力的强弱顺序均为：CSGP-A>CSGP>CSGP-B>CSGP-C，其中CSGP-A组分对自由基的清除效果最好，对·OH和O<,2><'->·的半数清除率浓度分别为0.0970 mg·mL<'-1>和0.0716 mg·mL<'-1>，是CSGP中抗氧化的强效组分。 10．通过建立环磷酰胺所致免疫抑制小鼠模型来考察丹参糖蛋白(CSGP)的免疫调节功能，结果表明丹参糖蛋白能刺激免疫抑制小鼠免疫器官的增长(P<0.01)，增强免疫抑制小鼠的巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力(P<0.01)；促进免疫抑制小鼠血清溶血素的生成(P<0.01)，提高免疫抑制小鼠抗体生成细胞的活力(P>0.05)；显著提高脾淋巴细胞的增殖能力(P<0.01)，提示丹参糖蛋白具有免疫调节作用。 研究表明，糖蛋白在丹参中不仅有较高的含量，而且有较高的生物活性，是一种极具开发前景的天然活性成分。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1丹参研究进展

1.1植物学特征与生药学鉴别特征

1.2丹参的化学成分

1.3丹参的药理研究

1.4丹参的临床应用

1.5丹参的膳食应用

2糖蛋白的研究进展

2.1糖蛋白研究的现状

2.2糖蛋白的结构

2.3糖蛋白的生物活性

2.4糖蛋白的研究方法

3本课题研究的内容和意义

3.1本课题研究的主要内容

3.2本课题研究的目的和意义

第二章丹参糖蛋白提取精制工艺研究

1试验材料、试剂及仪器

1.1试验材料

1.2试验试剂

1.3试验仪器

2试验方法

2.1丹参糖蛋白检测方法的建立

2.2原料预处理

2.3丹参糖蛋白提取精制工艺流程

2.4热水浸提法提取丹参糖蛋白工艺条件的研究

2.5超声波辅助法提取丹参糖蛋白工艺条件的研究

2.6丹参糖蛋白的精制

2.7丹参糖蛋白精制品(CSGP)的理化性质测定

3结果与分析

3.1丹参糖蛋白得率的计算

3.2热水浸提丹参糖蛋白的工艺研究结果

3.3超声波辅助提取丹参糖蛋白工艺条件的研究结果

3.4丹参糖蛋白的精制

3.5丹参糖蛋白精制品(CSGP)理化性质测定结果

4讨论

第三章丹参糖蛋白的分离纯化及结构分析

1试验材料、试剂及仪器

1.1试验材料

1.2试验试剂

1.3试验仪器

2试验方法

2.1丹参糖蛋白的分级纯化

2.2纯度鉴定

2.3分子量测定

2.4糖蛋白纯品的理化性质测定

2.5糖蛋白纯品的组成及结构分析

3结果与分析

3.1丹参糖蛋白精制品CSGP的DEAE-52纤维素柱层析结果

3.2CSGP-1、CSGP-3、CSGP-4三种级分的SephadexG-200凝胶柱层析

3.3纯度鉴定

3.4分子量测定

3.5糖蛋白纯品的理化性质

3.6糖蛋白纯品中糖和蛋白质含量

3.7糖蛋白纯品紫外光谱图解析

3.8丹参糖蛋白纯品红外光谱图解析

3.9糖蛋白纯品的组成

4讨论

第四章丹参糖蛋白的生物活性研究

1试验材料、试剂及仪器

1.1试验材料

1.2试验试剂

1.3试验仪器

2试验方法

2.1活性试验用丹参糖蛋白的制备方法

2.2丹参糖蛋白体外抗氧化活性评价

2.3丹参糖蛋白对小鼠免疫功能的影响

2.4统计学处理

3结果与分析

3.1体外抗氧化试验结果

3.2小鼠体内免疫活性试验结果

4讨论

结论

创新之处

参考文献

致谢

攻读学位期间的研究成果