抗乙肝病毒药物Bay41-4109的肝毒性及其机制研究

摘要

药物肝毒性是导致新药研发失败的一个重要原因，成为药物毒理学家急需解决的问题。功能基因组学技术在新药研发和药物安全性评价中的应用，为药物毒理学家预测先导化合物的毒性和研究毒作用机制提供了崭新的理论和手段。Bay41-4109是一种全新结构和作用方式的非核苷类抗乙肝病毒的药物，有很强的抗病毒活性，目前正处于早期研发阶段，但在早期毒理学研究方面其一般毒性、毒作用靶器官、毒作用机制均未开展系统研究。本课题采用传统的毒性试验和“组学”技术相结合的方法对Bay41-4109的肝毒性进行了研究，探讨其可能的毒作用机理，为Bay41-4109作为新型抗乙肝病毒药物的研发提供毒理学依据，并为转录组学和代谢组学技术在肝药酶诱导剂的肝毒性研究中的应用奠定基础。 研究发现Bay41-4109≥100mg/kg在Beagle犬引发的主要症状是精神萎靡，食欲减退，流涎，进食后呕吐，雌性动物症状更明显。血液学、血浆生化、凝血指标及尿液检查仅见血浆Tchol增高。病理检查发现Bay41-4109≥100mg/kg引起犬和大鼠肝细胞出现空泡变性，局部有小灶性坏死，大鼠肝细胞线粒体受损严重。此外Bay41-4109对大鼠CYP3A有轻度诱导作用，对总CYP450和CYP2B1/2有非常显著的诱导作用，其诱导CYP450的代谢酶谱改变与苯巴比妥基本一致。推断Bay41-4109基本无毒作用剂量为30mg/kg，肝脏是其主要毒作用靶器官之一。基因芯片结果显示，Bay41-4109引起大鼠肝脏基因表达改变主要与药物代谢及脂肪、氨基酸和能量代谢有关，其中对药物代谢Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ相酶的影响与苯巴比妥一致；体外试验也发现Bay41-4109对HepG2细胞基因表达谱的影响也主要与脂肪、能量代谢有关。提示Bay41-4109可能通过损伤线粒体，改变肝细胞脂肪、能量代谢进而影响肝细胞的功能，其分子机制可能与苯巴比妥通过CAR介导的多种生化过程改变一致。利用NMR技术检测Bay41-4109染毒后大鼠的尿液、血浆和肝组织萃取物中内源性代谢产物谱的变化则发现Bay41-4109在400mg/kg剂量下引起血浆中VLDL/LDL(CH2)n、VLDL/LDL-CH3、3-羟基丁酸盐、乳酸、丙酮酸、牛磺酸等代谢成分明显增高；尿液中3-羟基丁酸盐、乳酸、2-羟基丙酮、草酰乙酸、右旋葡萄糖等明显增高；肝组织水溶性萃取物中乳酸、丙酮酸、牛磺酸、胆碱、三甲胺-N-氧化物等代谢成分明显增高，右旋葡萄糖则降低。肝组织脂溶性成分的分析发现，一些饱和脂肪酸和不饱和的甘油三酸酯、磷脂和胆固醇发生改变。这些代谢成分的改变提示线粒体功能障碍导致能量代谢中的糖酵解、糖异生增强，脂肪酸氧化增强，与基因芯片的结果一致。对Bay41-4109染毒后尿液代谢组的时间轨迹分析表明，尿中乳酸、肌酐、丙酮酸、糖基可以作为Bay41-4109肝毒性的生物标志物研究。 综上，我们认为Bay41-4109是CYP450的强诱导剂，基本无毒作用剂量为30mg/kg，肝脏是其主要毒作用靶器官之一。Bay41-4109肝毒性可能的机制是通过CAR介导的肝脏药物代谢酶和与脂肪、能量代谢有关的酶的基因表达改变及损伤线粒体导致能量代谢中的糖酵解、糖异生增强，脂肪酸氧化增强，进而影响肝细胞功能。毒理基因组学和毒理代谢组学技术是研究肝药酶诱导剂的肝毒性的理想工具。传统毒性试验、毒理基因芯片和代谢组学三种手段结合能更全面地阐明药物的肝毒性，对新药研发阶段的药物毒理学研究有重大意义。

目录

前言

第一章：Bay41-4109的一般毒性研究

材料与方法

结果

一.Bay41-4109的小鼠急性毒性

二.Beagle犬口服Bay41-4140960天重复给药毒性1

二.Beagle犬口服Bay41-4140960天重复给药毒性2

三.Wistar大鼠重复给药28天毒性

四,Bay41-4109对大鼠肝脏CYP450的诱导效应

讨论

参考文献

第二章：利用基因芯片技术研究Bay41-4109的肝毒作用机制

转录组学的研究手段及研究策略

转录组学在药物肝脏毒性研究中的应用

材料与方法

结果

一.肝脏脏器系数

二.血浆生化指法标

三.组织病理学检查

四.Bay41-4109对HepG2细胸毒性(MTT比色法)

五.总RNA提取结果

六.基因芯片分析

七.差异表达基因的聚类分析

八.表达差异基因功能的初步分析

九.部分差异表达基因的RT-PCR验证

讨论

参考文献

第三章：大鼠Bay41-4109肝毒性的尿液、血浆及肝组织萃取物1H NMR谱分析

代谢组学的研究内容及研究手段

代谢组学在肝脏毒性研究中的应用

材料与方法

结果

讨论

参考文献

结论

致谢

附表1

附表2

文献综述1：某些化学物致肝损伤机制研究进展

文献综述2：肝脏毒理学研究中的体外试验模型

攻读学位期间撰写及发表的学术论文目录