PGRP双抗夹心酶联免疫吸附测定方法的建立及其在小细胞肺癌诊断中的应用

摘要

早期流行病学研究表明铀矿工肺癌以小细胞肺癌为主。肺癌是目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，按病理亚型可分为小细胞肺癌（s mall cell lung cancer，SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NS C LC），其中S C LC占所有肺癌患者的20-25％。SC LC分化程度较差，恶性程度较高，早期易发生远外转移，其最大的特点是对放化疗比较敏感，但通过病理及影像学方法难以获得早期诊断，可见SC LC的早期诊断尤为重要。
　　胃泌素释放肽前体（pro-gastrin releas ing peptide，PGRP）作为小细胞肺癌肿瘤标志物的临床应用价值已得到认可，在SC LC的早期诊断方面具有重要价值。
　　本文通过调研国内外人血清PG RP浓度检测方法，利用人工合成胃泌素释放肽前体抗原肽段（“N”—GSLKQQLREYIR；NLLGLIEAK;KENRNHQPPQ PKALG—“C”）的3个抗原位点对本实验室自行研制的19株单克隆抗体进行筛选，以结合抗原能力最强的单克隆抗体作为包被抗体。采用改良过碘酸钠法对筛选到的检测抗体进行辣根过氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）的标记；选择标记效果好、免疫活性佳的单克隆抗体作为检测抗体。利用合成的肽段确定经筛选的检测抗体和包被抗体结合不同抗原决定簇的特性，建立PGR P双单克隆抗体夹心酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）检测法。与市售德国IBL公司生产人血清PGRP检测试剂盒（ELISA法）采取配对实验共同检测癌症病人血清浓度，以评价本方法有效性及可行性。
　　结果在19株单克隆抗体中，E12株单抗和PG RP抗原结合能力最强，可作为包被抗体；ED1与DD2免疫活性强且与包被抗体具有不同的抗原结合位点，可作为酶标检测抗体。通过 E12、ED1、D D2建立的双抗夹心法具有检测背景值偏低、检测曲线线性良好、检测范围宽等优点；在与市售IBL公司试剂盒采用配对实验检测67例癌症病人血清PGRP浓度实验中发现，本方法检测灵敏度100%，特异度98.4%，IBL试剂盒检测灵敏度为100%，特异度92.2%。比较两种方法检测差异度，采用确切概率卡方检验法计算得出 P=1＞0.05，由此推论两种方法检测没有显著差异。
　　本文利用抗原肽段筛选出可用于包被捕获及酶标检测的单克隆抗体，并建立双单克隆抗体夹心酶联免疫吸附试验法，在降低检测背景值、避免结果值偏低和避免出现假阴性结果等方面要好于传统的多抗包被方式。本方法与市售的ELIS A检测试剂盒配对实验中结果表明本方法检测人血清PGRP有效可行。同时本文建立的PGRP双单抗夹心法可为血清学其他指标ELIS A检测方法的建立提供借鉴和参考。

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CONTENTS

中英文缩略语表

中文摘要

英文摘要

第一章综述

1 .1引言

1.1.1 肺癌概述

1.1.2 肿瘤标志物

1 .2 P GRP生物学特性

1 .3 P GRP临床应用价值

1.3.1 PGRP临床诊断价值

1.3.2 PGRP临床治疗价值

1 .4 P GRP检测方法

1.4.1酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immune Sorbent Assay，ELISA）

1.4.2时间分辨免疫荧光法（time-resolved immunofluorometricassay，TR-IFMA）

1.4.3液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）

1.4.4其他检测方法

1.4.5血浆检测影响

1 .5 P GRP其他应用

1 .6问题与展望

参考文献

第二章 双单抗夹心ELISA方法的建立及应用

2．1引言

2．2材料与方法

2.2.1材料

2.2.2方法

2 .3结果

2.3.1 单抗筛选

2 . 3 .2单克隆抗体HRP标记

2 . 3 .3双单抗夹心ELISA检测

2 . 3 .4多抗包被ELISA检测

2.3.5癌症病人血清检测

2 .4讨论

2 .5 结论

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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