c-Abl非受体酪氨酸激酶调节C/EBPβ转录活性的研究

摘要

以全长c-Abl为诱饵蛋白，通过酵母双杂交系统筛选c-Abl相互作用蛋白，发现转录因子C/EBPβ有可能与c-Abl相互作用。C/EBPβ是在众多细胞反应中发挥重要调节作用的转录因子，目前有关于C/EBPβ生物学功能的研究已经取得了相当的进展，但调节C/EBPβ活性的机理还不很明了。本论文在酵母双杂交实验的基础上，对c-Abl非受体型酪氨酸激酶(c-Abl和Arg)与C/EBPβ相互作用调节C/EBPβ转录活性进行了研究。 首先我们利用免疫沉淀、免疫印迹以及体外翻译、GST-pulldown实验证明c-Abl和Arg均能够与C/EBPβ在细胞内和体外直接相互作用；c-Abl通过其SH3、SH2结构域与C/EBPβ结合，表明c-Abl/Arg的SH3、SH2结构域是c-Abl/Arg和C/EBPβ相互作用的重要结构域，而C/EBPβ的N端和C端均能够结合c-Abl，表明c-Abl与C/EBPβ的结合可能与C/EBPβ的三维构象有关。进一步通过抗-P-Tyr抗体的免疫印迹实验和体外激酶分析，结果显示，c-Abl和Arg均可以使C/EBPβ酪氨酸磷酸化；酪氨酸磷酸化位点突变结果表明C/EBPβ的Y79是c-Abl和Arg的磷酸化位点。 在证明c-Abl结合C/EBPβ并可使其磷酸化的基础上，通过Pulse-chase实验发现c-Abl蛋白可以抑制C/EBPβ的降解，延长C/EBPβ的半衰期，进一步的研究结果表明，c-Abl对C/EBPβ稳定性调节不仅依赖于c-Abl蛋白，还与其激酶活性相关。通过将c-Abl、c-Abl(K290R)激酶突变体、Vector分别与C/EBPβ共表达，并在不同c-Abl激酶活性的细胞系内分别表达C/EBPβ，免疫印迹实验结果发现，c-Abl酪氨酸激酶能够抑制细胞内具有抑制转录活性C/EBPβLlP异构体的产生；进一步通过凝胶阻滞(EMSA)实验，证明Abl酪氨酸激酶能够促进C/EBPβ与il-6DNA靶序列的结合。 为了研究c-Abl非受体型酪氨酸激酶是否调节C/EBPβ的转录激活能力，本研究建立了C/EBPβ下游基因IL-6、hTOP1的荧光素酶报告系统，通过启动子活性分析试验，证明C/EBPβ能够正向和负向调控靶基因的转录，而c-Abl酪氨酸激酶通过磷酸化C/EBPβ调节C/EBPβ的转录激活能力。 最后，通过细胞周期同步化实验、免疫印迹和启动子活性分析试验，证明细胞周期依赖的c-Abl酪氨酸激酶通过磷酸化C/EBPβ调节C/EBPβ与细胞周期素D1的相互作用，并抑制c-Abl酪氨酸激酶刺激的细胞周期素D1表达。提示c-Abl酪氨酸激酶可能通过磷酸化C/EBPβ调节细胞周期素D1在细胞周期不同时相的表达水平，从而影响细胞周期的进行，在控制细胞增殖和分化过程中发挥关键作用。 迄今为止，已经报道的调节C/EBPβ活性的激酶主要是丝氨酸和苏氨酸激酶，尚无C/EBPβ受到酪氨酸磷酸化调控的报道。我们的研究首次证明c-Abl和ARG与转录因子C/EBPβ间存在相互作用，并对c-Abl酪氨酸激酶调节C/EBPβ调控的下游基因表达的机制和生物学功能进行了探讨，分析了c-Abl激酶和转录因子C/EBPβ调控细胞分化、增殖的可能机理。通过我们的研究，提示酪氨酸磷酸化可能是C/EBPβ参与细胞事件的另外一条重要信号途径，这对深入认识c-Abl家族酪氨酸激酶和转录因子C/EBPβ在正常细胞中的功能及致肿瘤机理具有重要的理论意义。

目录

详细摘要

缩略词表

前 言

1.转录因子C/EBPβ的结构、功能与调控

2.c-Abl酪氨酸激酶的结构与功能

材料和方法

1.材料

1.1引物合成及序列测定

1.2细胞株、菌株、质粒

1.3分子生物学工具酶

1.4细胞培养用品

1.5常用分子生物学试剂盒

1.6 Western-blot试剂

1.7大型仪器

2.方法

2.1常规PCR反应、重组质粒构建和阳性克隆的鉴定

2.2 Flag-C/EBPβ(Y79F)突变体的构建

2.3 GST-C/EBPβ截短突变体的构建

2.4 C/EBPβsiRNA表达载体的构建

2.5转染质粒的制备

2.6细胞培养、冻存与转染

2.7谷胱甘肽S转移酶(Glutathion S-transferase，GST)融合蛋白的制备

2.8免疫沉淀(Immunoprecipitation，IP)与免疫印迹(Immunoblot，IB)

2.9体外结合实验(GST-pull down)

2.10体外激酶分析

2.11蛋白质浓度的测定

2.12 Pulse-Chase实验检测蛋白质的半衰期

2.13荧光素酶活性检测

2.14细胞同步化实验

2.15流式细胞技术检测细胞周期

2.16凝胶阻滞实验

结果与分析

1.c-Abl/ARG与转录因子C/EBPβ之间存在相互作用

1.1 c-Abl和Arg与C/EBPβ在细胞内形成复合物

1.2 c-Abl与C/EBPβ直接结合

1.3 c-Abl与C/EBPβ相互作用结构域

2.C/EBPβ可被c-Abl/Arg磷酸化

2.1 c-Abl和Arg磷酸化C/EBPβ

2.2 C/EBPβ的Y79位酪氨酸被c-Abl和ARG磷酸化

3、c-Abl/Arg抑制转录因子C/EBPβ的降解

3.1 c-Abl/Arg调节细胞内C/EBPβ的表达水平

3.2 c-Abl抑制C/EBPβ降解

4、c-Abl酪氨酸激酶抑制细胞内C/EBPβ LIP异构体的形成

5、c-Abl酪氨酸激酶促进C/EBPβ与IL-6靶序列的结合

6、c-Abl调控C/EBPβ的转录激活活性

6.1酪氨酸磷酸化提高C/EBPβ对IL-6基因的转录激活作用

6.2酪氨酸磷酸化激活C/EBPβ对hTOP1基因的转录激活作用

7、C/EBPβ参与细胞周期素D1调节的生物学效应

7.1 Abl酪氨酸激酶调节C/EBPβ与Cyclin D的相互作用

7.2 C/EBPβ拮抗c-Abl对细胞周期素CyclinD1转录激活

7.3 C/EBPβ拮抗c-Abl对细胞周期素CyclinD1下游基因的转录激活

讨论

1.c-Abl酪氨酸激酶家族与转录因子C/EBPβ之间的相互作用

2.c-Abl酪氨酸激酶通过磷酸化影响C/EBPβ的转录活性

3.c-Abl调节C/EBPβ的DNA结合能力及LAP/LIP比例

4.c-Abl可通过对C/EBPβ酪氨酸磷酸化调控细胞周期

结 语

参考文献

文献综述 核转录因子C/EBPβ的研究进展

附 录

致 谢