RBSDV的分子鉴定及与其外壳蛋白特异性结合肽的筛选

摘要

水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）是严重危害禾本科作物生产的一种病毒.可引起水稻、小麦的黑条矮缩病和玉米粗缩病等.然而,引起中国玉米粗缩病的致病因子常常被认为是玉米粗缩病毒（MRDV）.该文研究通过从山东和浙江两省采集感病的玉米、水稻、小麦和高粱植株,分别抽提病毒dsRNA,经RT-PCR获得了病毒基因组片段S9和S10的全长cDNA.序列分析表明,中国病毒分离物S9和日本RBSDV S9具有较高的相似性（核苷酸水平：89.1-89.6﹪：氨基酸水平：ORF1和ORF2分别为92.3-92.9﹪和95.8-98.6﹪）;S10与日本RBSDV S10在核苷酸及氨基酸水平上的相似性分别为93.0-95.4﹪和96.2-97.0﹪.然而,中国病毒分离物的S9和S10与意大利MRDV相应片段在核苷酸和氨基酸相似性均低于与日本RBSDV的相似性.系统发生树分析表明,感染中国玉米、水稻、小麦和高粱并引起矮（粗）缩症状的病毒是同一种病毒-RBSDV.

目录

文摘

英文文摘

前言

一、水稻病毒的研究概况

二、感染植物的呼肠孤病毒科病毒的研究现状

2.1植物呼肠孤病毒的分类

2.2末端核苷酸序列

2.3基因组的编码特征

2.4病毒基因组序列的关系

三、水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)分子生物学研究进展

3.1感病植株症状

3.2病毒颗粒形态特征与结构组分

3.3病毒基因组结构特点

3.4 RBSDV和MRDV的同源性分析

3.5 RBSDV的防治策略

3.6 RBSDV分子生物学研究中存在的主要问题

第一章水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)的分子鉴定

1材料

1.1感病材料

1.2菌株和试剂

1.3 PCR引物序列

1.4主要的仪器设备

2方法

2.1病毒颗粒的提取和纯化

2.2病毒RNA的提取

2.3 cDNA第一链的合成

2.4 PCR产物的T-A克隆

2.5大肠杆菌感受态的制备

2.6大肠杆菌的转化

2.7大肠杆菌质粒的小量制备

2.8质粒酶切反应

2.9 DNA序列测定

2.10 DNA序列分析

3结果和讨论

3.1病毒颗粒的提取和纯化

3.2病毒RNA的提取

3.3 PCR扩增

3.4 S9和S10 DNA片段的序列测定

3.5 S9及S10的同源性分析

3.6系统发生树分析

第二章RBSDV S10编码的外壳蛋白基因的克隆、表达及其抗血清的制备

1材料

1.1材料和大肠杆菌菌株

1.2生化试剂

2方法

2.1病毒及RNA的提取

2.2 cDNA合成、克隆及序列分析

2.3 pGEX-S10表达载体的构建

2.4病毒基因在大肠杆菌中的表达和纯化

2.5 SDS-PAGE和Western印迹分析

2.6免疫动物

2.7免疫动物放血

2.8抗血清效价的测定

2.9点杂交检测水稻和灰飞虱体内的RBSDV

3结果和讨论

3.1 RBSDV S10 ORF的克隆及序列测定

3.2表达载体pGEX-S10的构建

3.3表达载体中插入片段的序列鉴定

3.4表达载体pGEX-S10在大肠杆菌中融合表达

3.5 GST融合蛋白的Western印迹分析

3.6抗血清的效价测定

3.7点杂交检测植物病株中的RBSDV

3.8点杂交检测灰飞虱体内的RBSDV

第三章从噬菌体随机肽库中筛选RBSDV外壳蛋白特异性结合肽

1材料

1.1主要试剂

1.2主要仪器

2方法

2.1菌株的活化和保存

2.2靶蛋白的包埋

2.3包埋平板的封闭

2.4与GST结合肽的消减

2.5噬菌体文库的第一轮筛选

2.6噬菌体滴度的测定

2.7噬菌体文库的第二、三轮筛选

2.8噬菌斑的挑选及扩增

2.9 ELSIA检测

2.10噬菌体序列测定

2.11短肽的融合表达

2.12短肽的合成

2.13点杂交和Western印迹

2.14蛋白构象的园二色(CD)分析

3结果与分析

3.1生物筛选的噬菌体富集

3.2噬菌体序列测序和分析

3.3短肽的融合表达

3.4点杂交及Western印迹分析

3.5蛋白构象的园二色(CD)分析

4讨论

参考文献

致谢

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