银杏叶提取物（GBE50）预防血管内皮功能障碍的体外实验研究

摘要

第一部分 银杏叶提取物GBE50(及其主成分总黄酮)对缺氧致人脐静脉内皮细胞凋亡及ROS生成的作用 目的：观察银杏叶提取物GBE50及其主成分总黄酮对缺氧致人脐静脉内皮细胞ROS生成及凋亡的保护作用。 方法：通过消化法获得人脐静脉内皮细胞 (HUVECs)，传代后干预分组如下：N组(正常对照)，H组(缺氧24h)，HG组(缺氧前GBE50干预4h)和HF组(缺氧前总黄酮干预4h)，其中GBE50和总黄酮各有3个浓度：12.5、25及50μg/ml。采用流式细胞仪测各组ROS(活性氧)水平及早期凋亡率(AnnexinV)，通过TUNEL，测晚期凋亡率，探讨缺氧及GBE50和总黄酮对内皮细胞凋亡及其ROS生成的影响。 结果： 1.H组ROS水平较N组明显增加，由(9.88±0.97)％升至(29.27±2.21)％，有显著性差异(P<0.05)；HG各浓度组与H组相比ROS水平均下降，但与N组及H组相比均无明显差异(P>0.05)；HF 各浓度组与H组相比ROS水平均明显下降(P<0.05)，其中总黄酮浓度为50μg/ml时ROS水平降至最低，为(7.42±1.81)％。 2.H组细胞AnnexinV阳性率较N组明显增加，由(9.00±1.00)％升至(18.47±2.53)％，有显著性差异(P<0.05)；HG25μg/ml时为(10.69±2.08)％，显著降低了内皮细胞的AnnexinV阳性率(P<0.05)；HF 各浓度组均能不同程度地降低AnnexinV阳性率，但尚无统计学差异(P>0.05)，该保护效应在总黄酮浓度为50μg/ml时最明显，AnnexinV阳性率为(14.25±2.22)％。 3.H组 TUNEL，阳性率较N组明显增加，由(1.28±0.65)％升至(8.59±1.10)％，有显著性差异(P<0.05)；HG 25μg/ml 时降至(3.58±0.28)％，HF50μg/ml为(3.06±0.40)％，较H组均明显下降(P<0.05)。 结论：缺氧可导致HUVEC ROS生成增加伴凋亡增多。而GBE 50及总黄酮可降低缺氧所致的ROS生成增多及凋亡增加，GBE50及总黄酮对缺氧所致的内皮功能障碍有一定的保护作用。 第二部分 银杏叶提取物GBE50对抗缺氧致内皮功能障碍的影响及部分机制探讨 目的：初步探讨银杏叶提取物GBE50对抗缺氧致人脐静脉内皮细胞功能障碍的分子机制。 方法：通过消化法获得HUVEC，传代后干预分组如下：N组(正常对照)，NG组(GBE50 25μg/ml干预4h后不予缺氧处理)，H 组 (缺氧24h)及HG组(GBE5025μg/ml干预4h后缺氧24h)。应用RT-PCR半定量检测各组vWF(von Willebrand因子)、ET-1 (内皮素-1) 及PPAR γ (过氧化物酶体增殖物激活受体γ)的mRNA表达水平，运用Western-blot测各组eNOS(内皮型一氧化氮合酶)及PPAR γ的蛋白表达水平。 结果： 1.vWF的mRNA表达水平：N组为(0.55±0.05)％，H组为(0.84±0.14)％，H组vwF表达较N组明显增加 (P<0.05)；HG组为(0.58±0.24)％，与H组相比明显降低(P<0.05)。 2.ET-1的mRNA表达水平：N组为(0.14±0.03)％，H组为(0.31±0.03)％，H组ET-1 表达较N组明显增加(P<0.05)；HG为(0.26±0.02)％，与H组相比明显降低(P<0.05)。 3.eNOS蛋白表达水平：H组eNOS蛋白表达较N组明显增加，由(0.30±0.04)％升至(0.59±0.08)％，有显著性差异(P<0.05)；HG组降至(0.43±0.08)％，但与其它各组相比无统计学差异(P>0.05)。 4.PPAR γ的mRNA表达水平：N组为(0.40±0.02)％，H组为(0.42±0.01)％，HG组为(0.42±0.01)％，各组之间无差异(P>0.05)。5.PPARγ的蛋白表达水平：N组为(0.10±0.02)％，H组为(0.13±0.05)％，HG组为(0.13±0.04)％，各组相比无改变(P>0.05)。结论内皮细胞缺氧损伤时可导致ET-1、vWF及eNOS的表达增加，内皮细胞在缺氧前给予GBE50 25μg/ml后，可降低缺氧导致的ET-1、vWF的表达增加，部分降低因缺氧导致的eNOS蛋白表达的增高，提示缺氧及GBE50对上述因子的表达起作用。缺氧及GBE50对PPAR γ的mRNA及蛋白水平均无影响，提示缺氧及GBE50不通过PPARγ途径起作用。 第三部分 银杏叶提取物GBE50在缺氧致内皮功能障碍中抗凋亡作用的初步研究 目的： 探讨银杏叶提取物GBESO对缺氧致人脐静脉内皮细胞凋亡信号分子mRNA表达水平的调节。 方法：应用人细胞凋亡基因表达谱cDNA芯片筛选出凋亡通路上的差异表达基因谱，再运用RT-PCR对部分差异基因进行鉴定。 结果： 1.基因芯片结果：缺氧干预内皮细胞24小时后，H组(缺氧24h)较N组(正常对照)上调了15个基因；而HG组(缺氧前4h予GBE 50 25μg/ml进行干预)较N组上调了38个基因，下调了69个基因。 2.RT-PCR验证结果：内皮细胞经缺氧损伤后，ATM(毛细血管扩张性共济失调症突变基因)的mRNA表达由N组的(0.40±0.01)％升至H组的(0.47±0.og)％，H组较N组明显增加(P<0.05)；HG组则降至(0.23±0.11)％，较H组明显降低(P<0.05)。TNFSF10(肿瘤坏死因子超家族成员10)mRNA的表达N组为(0.05±0.01)％，H组为(0.20±0.13)％，H组较N组明显增加 (P<0.05)：HG组降至 (0.01±0.01)％，较H组明显降低(P<0.05)。 结论： ATM及TNFSF10两者mRNA水平表达的改变和缺氧及GBESO的干预密切相关。ATM及 TNFSF10在缺氧致内皮细胞凋亡及GBE50抗内皮细胞凋亡中起到重要作用。

目录

论文说明：缩略语

声明

摘要

前言

第一部分银杏叶提取物GBE50(及其主成分总黄酮)对缺氧致HUVEC凋亡及ROS生成的作用

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分银杏叶提取物GBE50对抗缺氧致内皮功能障碍的影响及部分机制探讨

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分银杏叶提取物GBE50在缺氧致内皮功能障碍中抗凋亡作用的初步研究

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

综述 细胞凋亡及其调控

发表论文

致谢